大花珊和國蘭粉活性測定方法的比較

大花珊和國蘭粉活性測定方法的比較

大花喜蘭是優(yōu)良的品種，以蘭花科或木蘭科的一些大型花種為父本，通過雜交和繁殖培育而成。大花蕙蘭是重要的商品盆花和鮮切花之一,花型大、色彩鮮艷、生長強(qiáng)健,但是缺少國蘭的幽香。國蘭是指蘭屬植物中的一部分地生種,主要包括春蘭C.goeringii,春劍C.goeringiivar.longibracteatum,蕙蘭C.faberi,建蘭C.ensifolium,墨蘭C.sinense,寒蘭C.kanran和蓮瓣蘭C.lianpan等7個(gè)種系。國蘭不僅花型小巧、極具芳香而且葉態(tài)優(yōu)美,深受人民喜愛。利用大花蕙蘭和國蘭進(jìn)行雜交育種的工作近幾年已經(jīng)引起不少學(xué)者的重視。花粉活力和柱頭可授性是直接影響蘭科植物雜交成功的重要因素之一。早期的蘭科植物花粉活力研究主要集中在離體萌發(fā)培養(yǎng)基成分的篩選方面,例如蔗糖濃度的選擇、植物激素以及柱頭粗提物或提取液等外源添加物。王利民等報(bào)道了大花蕙蘭雜交品種花粉的離體萌發(fā)特性;郭麗霞等對(duì)海南原生的墨蘭花粉進(jìn)行了離體培養(yǎng)萌發(fā)研究。但對(duì)于大花蕙蘭和國蘭的花粉活力測定及柱頭的可授性則未見報(bào)道。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,對(duì)大花蕙蘭和國蘭花粉活力與柱頭可授性進(jìn)行了分析,旨在為蘭花雜交育種工作提供參考與借鑒。1材料和方法1.1大花推動(dòng)蘭與國蘭的開花試驗(yàn)如表1所示:供試驗(yàn)的大花蕙蘭材料來自云南,品種有‘綠寶’‘Emerald’,‘光彩’‘Shine’,‘皇后’‘PrincessNobuko’,‘夢境’‘Wanderland’,‘龍袍’‘NachiYellow’等5個(gè)品種。國蘭材料來自浙江、四川和云南,共選取4個(gè)不同的種或品種。觀察記錄開花時(shí)間并做好標(biāo)記,對(duì)大花蕙蘭設(shè)定0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60d等13個(gè)開花時(shí)間,對(duì)國蘭設(shè)定0,5,10,15,20,25,30d等7個(gè)開花時(shí)間。在所設(shè)計(jì)的開花時(shí)間分別采集花粉和柱頭帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。如圖1所示:大花蕙蘭與國蘭的花粉均為4個(gè)花粉塊,兩兩相連,花粉塊為黃色位于合蕊柱先端的藥帽之下。試驗(yàn)前用玻璃棒將軟硬程度不同的花粉塊輕輕碾壓為粉末狀。稍硬的花粉塊可在輕壓后放入少量蒸餾水,然后攪拌,花粉塊則在水中分散開。1.2測定花粉的生活能力1.2.1花粉的生活力TTC染色法是根據(jù)花粉粒的呼吸酶活性來判斷花粉生活力,呼吸酶的活躍情況能較準(zhǔn)確地反映花粉生活力的強(qiáng)弱,同時(shí)氧化還原染料能在呼吸酶的作用下著色。將不同種或品種和不同開花時(shí)間的花粉分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%TTC溶液染色,染色后在100倍體視鏡下觀察染色情況,統(tǒng)計(jì)花粉染色率,花粉生活力(%)=(有活力的花粉/觀察花粉總數(shù))×100。試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.2花粉活力的測定參照趙宏波等的方法配置碘-碘化鉀溶液。取9個(gè)種或品種不同開花時(shí)間的花粉,分別加入碘-碘化鉀溶液,置于30℃的恒溫箱中20~30min后,在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉活力,試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.3花粉活力的測定同樣取9種或品種不同開花時(shí)間的花粉,分別加入體積分?jǐn)?shù)為45%醋酸洋紅溶液,置于25℃的恒溫箱中20~30min,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉活力,試驗(yàn)重復(fù)3次。1.3條件三:最有利于授粉時(shí)間蘭花接受花粉的部位在藥帽下的腔內(nèi),腔內(nèi)充滿無色透明的分泌物,如果分泌物油光發(fā)亮,則表示是最好的授粉時(shí)間。分別將大花蕙蘭開花后0~80d的柱頭和國蘭開花后0~40d的柱頭剪下,放入聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液中,觀察10min,若柱頭有可授性則會(huì)使周圍反應(yīng)液變藍(lán)并出現(xiàn)大量氣泡。這是因?yàn)檠趸锩富钚越到膺^氧化氫和氧化聯(lián)苯胺。試驗(yàn)重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1各品種花粉活力檢測研究發(fā)現(xiàn):TTC染色法的最佳觀察時(shí)間是染色后12h。大花蕙蘭與國蘭的花粉活力均隨著開花時(shí)間的延長,經(jīng)歷從弱變強(qiáng)再變?nèi)醯倪^程(圖2)。大花蕙蘭在開花后0~25d內(nèi)花粉活力處在增長期,25~35d的花粉活力最佳,35d后花粉的活力開始變差。各品種間花粉活性有一定差異,花粉活力大小依次為‘綠寶’>‘光彩’>‘皇后’>‘夢境’>‘龍袍’。國蘭在開花后0~15d內(nèi)花粉活力處于增長期,15~25d的花粉活力最佳,30d花粉的活力開始變差,各品種花粉活力大小依次為春蘭‘黃金荷’>春蘭‘宋梅’>春劍>蓮瓣蘭。用碘-碘化鉀染色法染色的大花蕙蘭與國蘭花粉,在體視鏡下(放大100倍)沒有觀察到明顯的顏色變化。在低溫和高溫處理以及時(shí)間做相應(yīng)的延長調(diào)整后進(jìn)行觀察,染色效果也不好。用碘-碘化鉀染色后的國蘭花粉比大花蕙蘭的染色效果略明顯。醋酸洋紅染色法的染色原理是靠花粉中的脫氫輔酶而染色。當(dāng)花粉失去活力時(shí),該酶的活性仍然存在,使得測定結(jié)果偏高。采用醋酸洋紅染色法所測的大花蕙蘭和國蘭花粉,各品種間不同天數(shù)花粉的染色率都在90%以上,沒有差異。因此醋酸洋紅法不適合大花蕙蘭和國蘭花粉活力的測定。2.2大花慧蘭和國蘭的柱頭2.2.1含過氧化物酶活性的透性三種方法檢測指標(biāo)由表2可見:大花蕙蘭開花后10d內(nèi),柱頭的過氧化物酶活性較低,且僅有少量氣泡產(chǎn)生;15d后,已具有較強(qiáng)的過氧化物酶活性,柱頭遇聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液反應(yīng)產(chǎn)生氣泡;20~40d內(nèi)柱頭產(chǎn)生大量氣泡,可授性達(dá)到最強(qiáng);45d后,柱頭轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?氣泡逐漸減少,可授性明顯減弱;80d后,柱頭為深褐色,過氧化物酶活性基本消失,柱頭失去可授性。大花蕙蘭不同品種間差異不大。2.2.2過氧化物酶活性國蘭開花后5d內(nèi),柱頭的過氧化物酶活性較低,產(chǎn)生少量氣泡;10d后,已具有強(qiáng)過氧化物酶活性,氣泡逐漸增多;15~25d內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生,柱頭可授性達(dá)到最強(qiáng);30d后,柱頭轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?氣泡開始減少,可授性明顯減弱;40d后,柱頭為深褐色,過氧化物酶活性基本消失,柱頭失去可授性。各品種間差異不大。3花粉活力的測定蘭屬植物花粉活力和柱頭可授性研究在國內(nèi)報(bào)道較少,僅有凌春英等采用離體培養(yǎng)法和TTC染色法對(duì)大花蕙蘭和墨蘭的花粉活力和儲(chǔ)藏進(jìn)行了研究?；ǚ刍盍κ軠囟取⒒ㄆ陂L短等因素的影響,同時(shí)蘭花花粉呈塊狀,在分離時(shí)比較困難,一定程度上增加了研究難度。本研究采用3種染色方法對(duì)大花蕙蘭和國蘭的花粉活力進(jìn)行研究,得出TTC染色法是觀察花粉活力最直觀的方法。由于蘭科植物花粉外面包裹了類脂膜,對(duì)花粉活力的保持起到了相當(dāng)重要的作用,這也可能是影響碘-碘化鉀和醋酸洋紅染色法染色時(shí)花粉不易著色的主要原因。TTC對(duì)于花粉活力測定結(jié)果的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步結(jié)合有性雜交來進(jìn)行檢驗(yàn)。柱頭可授性是花朵成熟過程中的一個(gè)重要時(shí)期,它在很大程度上影響著