環(huán)氧化酶-2調(diào)節(jié)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜新生血管形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

環(huán)氧化酶-2調(diào)節(jié)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜新生血管形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

早產(chǎn)視?。╮op）是兒童盲的主要原因之一。已知rop的發(fā)生與早期早產(chǎn)的氧氣處理有關(guān)，但目前rop的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸生物合成前列腺素的重要限速酶,它存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜的表面,包括2個(gè)亞型:COX-1和COX-2。研究表明COX催化合成的前列腺素可以影響很多生物學(xué)過程,包括缺血引起的增殖性視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜新生血管形成等,也有研究證實(shí)COX-2與ROP的視網(wǎng)膜新生血管生成有著密切的關(guān)系。本研究采用COX-2選擇性抑制劑NS-398抑制COX-2的表達(dá),觀察視網(wǎng)膜新生血管形成的改變及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表達(dá),并研究在此過程中PI3K/Akt信號(hào)表達(dá)的變化。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和pcr擴(kuò)增COX-2選擇性抑制劑NS-398購自Sigma公司(美國(guó));COX-2、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(又名蛋白激酶B,serine-threonineproteinkinase,Akt)及VEGF抗體購自SantaCruz公司(美國(guó));EK1001及EK1002試劑盒購自武漢博士德公司;FeroTecGradienPCR基因擴(kuò)增儀購自杭州大和熱磁電子有限公司;Rotor-Gene3000Real-timePCR儀為CorbettResearch公司(澳大利亞)產(chǎn)品;CY-7型測(cè)氧儀購自浙江省建德市梅城電化分析儀器廠。1.2fp3型動(dòng)物中心生長(zhǎng)C57BL/6J孕鼠由武漢大學(xué)A3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,在武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,母鼠給予標(biāo)準(zhǔn)的近交系小鼠飼料和飲水,并暴露在正常的12h光照-黑暗環(huán)境中。1.3小鼠氧濃度檢測(cè)將乳鼠隨機(jī)分為3組(每組有18只乳鼠):①正常對(duì)照組,小鼠出生后一直生長(zhǎng)于正?？諝庋鯘舛?21%)環(huán)境中;②氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)模型組,參照文獻(xiàn)建立OIR小鼠模型;③NS-398組,建立OIR小鼠模型并于出生后第12～17天每日腹腔注射10mg/kgNS-398。于出生后第7天將OIR模型組和NS-398組乳鼠與母鼠一起放置到(75%±2%)氧濃度的環(huán)境中,共5d,使用CY-7型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)氧濃度,每日檢測(cè)3次。第12天時(shí)調(diào)整氧氣濃度為21%,小鼠在此環(huán)境中飼養(yǎng)至第17天。1.4視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查在17d鼠齡時(shí),腹腔注射戊巴比妥120mg/kg處死小鼠,摘取小鼠雙眼眼球,每組隨機(jī)選擇12只眼球行病理學(xué)檢查。其它眼球取出視網(wǎng)膜組織并立即凍存于液氮中以備Westernblot(n=8)及Real-timePCR(n=8)檢測(cè)用。行病理學(xué)檢查的眼球在4%多聚甲醛中固定24h,石蠟包埋,以3μm厚度切片,每個(gè)眼球每間隔30μm取切片5張行蘇木精-伊紅染色,雙盲法計(jì)數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核的數(shù)目。1.5cox-2和vegf的表達(dá)隨機(jī)選擇未染色的切片,采用鏈霉素抗生素蛋白-生物素復(fù)合物(SABC)法檢測(cè)COX-2和VEGF的表達(dá)。表達(dá)陽性的細(xì)胞著染呈淡黃色至棕褐色。每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野,用計(jì)算機(jī)圖像分析儀進(jìn)行灰度掃描,分別測(cè)定COX-2和VEGF表達(dá)的吸光度值(A),取其平均值作為分析指標(biāo)。1.6小鼠cox-2基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)將液氮凍存的視網(wǎng)膜組織(50～100mg)勻漿提取總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板,并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋。將梯度稀釋的DNA模板及所有cDNA樣品分別配置成25μlReal-timePCR反應(yīng)體系,使用Rotor-Gene3000Real-timePCR儀進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)。小鼠COX-2上游引物為5′-GCCAATAGAACTTCCAATCCG-3′,下游引物為5′-GAAATACGGGTAACAGGATCT-3′。VEGF上游引物為5′-CTTGTTCAGAGCGGAGAAAGC-3′,下游引物為5′-TTGCTTGCATGAACGTCTACA-3′。反應(yīng)條件為:95℃,5min;35個(gè)PCR循環(huán)(95℃,10s;58℃,15s;72℃,20s;81℃收集熒光,5s)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃(每5秒升高1℃)。所有標(biāo)本檢測(cè)均重復(fù)3次。用標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)定量法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。1.7sds-東南角電泳分離和電泳分離將液氮保存的視網(wǎng)膜標(biāo)本放入勻漿器中,加入含PMSF裂解液,充分勻漿后離心,取上清液保存。取分析樣品與上樣液混合,SDS電泳分離,電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,使用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫雜交,然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影和定影。用QuantityOne凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1無側(cè)腦內(nèi)界膜新生血管正常小鼠的眼球病理切片上未能見到與內(nèi)界膜相連的到達(dá)玻璃體腔中的新生血管,僅在靠近晶狀體的玻璃體腔中見到未能完全退化的血管,部分僅為與晶狀體相連的未完全退化的細(xì)胞核。OIR模型組12只眼球標(biāo)本全部出現(xiàn)與內(nèi)界膜相連的新生血管,新生血管粗大,可見到其中的紅細(xì)胞,鄰近晶狀體的原玻璃體腔中未退化的血管管腔也很粗大。NS-398組12只眼球標(biāo)本中有7只出現(xiàn)新生血管,較OIR模型組管腔細(xì)小,部分僅以出芽方式形成向玻璃體腔的突起(圖1)。2.2組不同的血管n對(duì)玻璃體腔內(nèi)的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞(包括與內(nèi)界膜相連的新生血管以及原玻璃體腔內(nèi)的未退化的血管)進(jìn)行計(jì)數(shù),其結(jié)果為正常對(duì)照組(11.54±4.15)個(gè);OIR組(47.58±15.92)個(gè);NS-398組(36.42±13.85)個(gè)。經(jīng)過配對(duì)資料t檢驗(yàn),3組之間的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。2.3各組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)vegf表達(dá)情況的比較在正常小鼠視網(wǎng)膜可以檢測(cè)到微弱的COX-2表達(dá),主要在內(nèi)、外叢狀層以及內(nèi)核層;而在OIR模型組COX-2呈強(qiáng)表達(dá),且表達(dá)于突破內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中;在NS-398組中COX-2也有較強(qiáng)表達(dá)。用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行灰度掃描,結(jié)果表明COX-2在OIR模型組中表達(dá)最強(qiáng);在NS-398組中的表達(dá)較弱,但仍高于正常小鼠組(P<0.05)(圖2)。在正常小鼠的視網(wǎng)膜組織的內(nèi)核層和血管內(nèi)皮細(xì)胞中僅有微弱的VEGF表達(dá),在OIR模型組小鼠的視網(wǎng)膜中VEGF的表達(dá)強(qiáng)度最高,NS-398組的VEGF表達(dá)強(qiáng)度下降但仍高于正常小鼠組(P<0.05)(圖3);正常對(duì)照組、OIR模型組和NS-398組COX-2的A值分別為(0.30±0.12),(3.90±0.12)和(1.99±0.26),VEGF的A值分別為(1.56±0.15),(5.96±0.35)和(3.45±0.22),3組間兩兩比較,差異均有顯著性意義(均P<0.05)。2.4cox-2擴(kuò)增的表達(dá)Real-timePCR的熔解曲線顯示COX-2和VEGF各自在86℃和88℃附近有一單峰,表明擴(kuò)增具有特異性。相對(duì)定量分析結(jié)果表明COX-2表達(dá)在OIR模型組最高,為正常對(duì)照組的3.5倍;NS-398組的表達(dá)為正常對(duì)照組的2.32倍。VEGF的表達(dá)在OIR模型組為正常對(duì)照組的3.8倍,NS-398組為正常對(duì)照組的2.73倍(圖4)。2.5dk/akt及vegf的表達(dá)正常對(duì)照組中有明顯的COX-2、PI3K/Akt及VEGF的表達(dá);上述蛋白質(zhì)的表達(dá)在OIR模型組顯著增高,在NS-398組表達(dá)明顯下降(圖5)。3cox-2和vegf對(duì)視網(wǎng)膜新生血管生成的作用環(huán)氧化酶(COX)是催化花生四烯酸生物合成類花生四烯酸物質(zhì)頭兩步的限速酶,它存在2個(gè)亞型——COX-1和COX-2。COX-1的主要作用是維持前列腺素的水平以實(shí)現(xiàn)不同的生理功能,而COX-2的表達(dá)可以由不同的刺激如缺血、有絲分裂以及炎癥等引起。作為這些酶作用產(chǎn)物的前列腺素可以影響缺血性增殖性視網(wǎng)膜病變的生物學(xué)過程,包括視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。其他的研究則證實(shí)COX-2的選擇性抑制劑可以減輕癌癥、肉芽組織、關(guān)節(jié)炎的新生血管形成。在眼部,研究已經(jīng)證實(shí)COX-2在視網(wǎng)膜新生血管性疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞等疾病的視網(wǎng)膜新生血管生成過程中扮演著關(guān)鍵的角色。而進(jìn)一步的研究則證實(shí)抑制COX-2的表達(dá)可以顯著減少ROP動(dòng)物模型中的視網(wǎng)膜新生血管形成,但是我們對(duì)于COX-2通過何種機(jī)制作用于視網(wǎng)膜的新生血管形成過程知之甚少。本實(shí)驗(yàn)通過建立ROP的動(dòng)物模型——OIR小鼠模型來研究COX-2對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的作用及其機(jī)制,結(jié)果表明COX-2抑制劑NS-398可以顯著抑制低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成。VEGF是一個(gè)強(qiáng)有力的促血管生成因子,近年來的研究已經(jīng)證實(shí)它在新生血管形成過程中居于中心地位,VEGF的表達(dá)決定了很多新生血管性疾病的狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中我們用免疫組化、Real-timePCR及Westernblot方法檢測(cè)COX-2和VEGF的表達(dá),結(jié)果表明在OIR模型組中COX-2和VEGF的表達(dá)顯著升高,與正常對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而給予NS-398的實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)量明顯下降(P<0.05),但仍然高于正常對(duì)照組(P<0.05)。說明NS-398組視網(wǎng)膜新生血管生成的減少與VEGF的表達(dá)量降低有關(guān),而給予COX-2抑制劑是引起VEGF表達(dá)量發(fā)生變化的原因,因此我們推測(cè)COX-2選擇性抑制劑在抑制COX-2的表達(dá)后,通過降低VEGF的表達(dá)從而抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成。為了探討在低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管生成過程中是否涉及到PI3K/Akt信號(hào)途徑的作用,我們用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了PI3K/Akt蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示在3個(gè)組中PI3K/Akt蛋白質(zhì)與CDX-2和VEGF有相類似的表達(dá)趨勢(shì):在正常對(duì)照組表達(dá)量最低,在OIR模型組表達(dá)量最高,而在NS-398組表達(dá)量下降,但是仍然高于正常對(duì)照組。數(shù)據(jù)有力地說明這些信號(hào)蛋白質(zhì)的表達(dá)與OIR模型中視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān),而COX-2的抑制導(dǎo)致了PI3K/Akt信號(hào)的活化抑制以及VEGF的