植物激素對(duì)小麥衰老過(guò)程中生理生化指標(biāo)的影響

植物激素對(duì)小麥衰老過(guò)程中生理生化指標(biāo)的影響

葉片退役是葉片生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的最后一步，對(duì)于植物的正常發(fā)育是必要的。旗葉是小麥關(guān)鍵源器官,在籽粒灌漿期,旗葉的衰老引起葉片以及整個(gè)植株生理生化代謝的改變,影響籽粒發(fā)育并最終限制產(chǎn)量。因此,研究小麥旗葉衰老過(guò)程中的生理生化指標(biāo)的變化動(dòng)態(tài),對(duì)于延緩衰老進(jìn)程,防止早衰發(fā)生,提高小麥產(chǎn)量有重要意義。植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及葉片衰老受植物激素的調(diào)控。脫落酸(ABA)在植物生理代謝活動(dòng)中有重要作用,可減輕環(huán)境脅迫對(duì)植物的傷害,調(diào)控植物衰老。Hu等認(rèn)為ABA能提高水脅迫環(huán)境下玉米幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性,提高葉片抗氧化能力。黃鳳蓮等發(fā)現(xiàn)ABA減緩低溫脅迫下水稻幼苗SOD和過(guò)氧化物酶(POD)活性的降低,維持相對(duì)較高活性。Travaglia等指出外源ABA處理使小麥葉片保綠時(shí)間長(zhǎng),葉綠素降解延緩。研究表明,經(jīng)ABA處理的葉片SOD和POD活性提高,膜系統(tǒng)穩(wěn)定性增強(qiáng),ABA可誘導(dǎo)產(chǎn)生膜蛋白。細(xì)胞分裂素類物質(zhì)對(duì)作物抗氧化酶活性的影響已有研究報(bào)道,張海娜等用外源6-芐基腺嘌呤(6-BA)處理棉花,提高了下位葉的CAT活性,降低了細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度;Liu和Huang試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),通過(guò)外源注射玉米素(ZR)有效減輕高溫脅迫對(duì)匍莖剪股穎的傷害,ZR使SOD、CAT保持較高活性,同時(shí)降低MDA含量;邵瑞鑫等研究認(rèn)為外源激動(dòng)素能夠維持玉米生育后期較高的葉綠素含量,維持葉綠體機(jī)構(gòu)的穩(wěn)定性而延緩葉片衰老;王彥榮等提出水稻葉片衰老受ZR和ABA平衡關(guān)系的調(diào)控。旗葉在灌漿期的衰老進(jìn)程因品種的遺傳差異而具多樣性,劉洋等和羅培高等曾報(bào)道不同持綠型小麥的衰老進(jìn)程,但不同持綠型小麥品種旗葉衰老進(jìn)程及其激素調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。本試驗(yàn)選用持綠型和非持綠型小麥品種進(jìn)行花后葉面噴施ABA和6-BA處理,分析旗葉葉綠素含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、內(nèi)源激素含量和抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,旨在研究不同持綠型小麥品種衰老過(guò)程中生理生化代謝差異,深入認(rèn)識(shí)激素在抗氧化調(diào)控衰老上的作用機(jī)制,為生長(zhǎng)調(diào)控及防止早衰提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1供試項(xiàng)目及分組2010—2011年在山東泰安山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)(36°9′N,117°9′E)進(jìn)行田間試驗(yàn)。試驗(yàn)地耕層(0~20cm)土壤含有機(jī)質(zhì)12.3gkg-1、全氮0.91gkg-1、堿解氮87.2mgkg-1、速效磷8.6mgkg-1、速效鉀57.5mgkg-1。小區(qū)面積為9m2(3m×3m),隨機(jī)排列。播種前施純氮120kghm-2、P2O5100kghm-2、K2O100kghm-2,拔節(jié)期追施純氮120kghm-2。供試品種為持綠品種汶農(nóng)6號(hào)和非持綠品種濟(jì)麥20,于2010年10月10日播種,種植密度均為225株m-2,2011年6月16日收獲。生長(zhǎng)期田間管理同一般高產(chǎn)田。于盛花期開始,每天16:00左右葉面噴施ABA和6-BA(美國(guó)Sigma公司),連噴4d。為使激素能更好地附著于葉片,噴施前將激素與0.5%(V/V)吐溫-20(美國(guó)Sigma公司)混合配成10mgL-1,用量為100mLm-2。以噴施清水(含0.5%吐溫-20)為對(duì)照,每處理3次重復(fù),每重復(fù)為9m2。選各處理生長(zhǎng)一致小麥植株掛牌標(biāo)記,每7d取一次樣,每次取旗葉20片保存于-40℃冰箱中。1.2測(cè)量設(shè)計(jì)和方法1.2.1綠葉含量用95%酒精20mL提取至葉片完全失綠,按趙世杰等的方法測(cè)定665、649和470nm波長(zhǎng)下的吸光度,計(jì)算葉綠素含量。1.2.2可溶性蛋白質(zhì)含量1.2.3sda包括參照趙世杰等的方法,用雙組分光光度法分別測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物在600、532和450nm下的吸光度,計(jì)算MDA含量。1.2.4simme生長(zhǎng)曲線采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定旗葉中4種內(nèi)源激素的含量。流動(dòng)相甲醇∶乙腈∶0.6%乙酸為50∶45∶5(V/V),所用分析柱為SymmetryC18(150mm×4.6mm,5μm),柱溫為25℃,流動(dòng)相流速0.6mLmin-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。ZR、赤霉素(GA3)、生長(zhǎng)素(IAA)和ABA標(biāo)樣均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。1.2.5葉片sod、cat和pod活性用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定SOD活性,愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性,過(guò)氧化氫法測(cè)定CAT活性。1.2.6產(chǎn)量每處理收獲1m2統(tǒng)計(jì)穗數(shù),收獲后脫粒、晾干和稱重,計(jì)算產(chǎn)量,3次重復(fù)。1.3統(tǒng)計(jì)分析用DPS7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),用SigmaPlot10.0繪圖。2結(jié)果與分析2.1持綠型品種在生育后期的葉綠素含量?jī)善贩N旗葉葉綠素含量隨植株發(fā)育進(jìn)程呈降低趨勢(shì),花后7~14d迅速下降,花后14~28d相對(duì)穩(wěn)定,之后又開始下降(圖1)。汶農(nóng)6號(hào)葉綠素含量高于濟(jì)麥20,其中花后35d,汶農(nóng)6號(hào)對(duì)照處理比濟(jì)麥20高74.2%,表明持綠型品種在生育后期有較高的葉綠素含量,使旗葉有較高光合產(chǎn)物制造能力。外源ABA及6-BA處理,均能顯著提高花后7~21d旗葉葉綠素含量,其中噴施ABA和6-BA后,汶農(nóng)6號(hào)花后7d的旗葉葉綠素含量分別提高15.4%和27.8%,濟(jì)麥20的旗葉葉綠素含量分別提高13.3%和17.2%,說(shuō)明在花后噴施脫落酸和細(xì)胞分裂素能提高葉綠素含量,有利于延緩葉綠素降解。2.2aba對(duì)旗葉可溶性蛋白的影響兩品種旗葉可溶性蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)不同,汶農(nóng)6號(hào)呈先降低再升高后再降低的趨勢(shì),而濟(jì)麥20則呈升高—降低—升高—降低的趨勢(shì),但兩品種旗葉可溶性蛋白質(zhì)在花后28d有最大含量,之后迅速下降(圖2)。汶農(nóng)6號(hào)旗葉可溶性蛋白含量高于非持綠型濟(jì)麥20,其中花后28d濟(jì)麥20對(duì)照處理比汶農(nóng)6號(hào)低16.5%。ABA處理后可溶性蛋白含量,在花后7~21d旗葉差異不顯著,但在花后28~35d顯著提高,其中汶農(nóng)6號(hào)和濟(jì)麥20花后28d分別提高18.8%和22.8%。外源6-BA處理則顯著提高兩品種旗葉7~35d可溶性蛋白質(zhì)含量,其中花后28d汶農(nóng)6號(hào)和濟(jì)麥20分別提高33.7%和30.1%。2.3外源ba處理對(duì)旗葉mda的增加兩品種小麥旗葉在衰老過(guò)程中MDA含量逐漸增加,花后7~14d積累較快,花后14~28d呈“V”字型趨勢(shì),花后28~35dMDA的積累加速(圖3)。濟(jì)麥20旗葉中MDA含量高于汶農(nóng)6號(hào),表明濟(jì)麥20膜脂過(guò)氧化程度較高,持綠型汶農(nóng)6號(hào)抗氧化能力強(qiáng)于濟(jì)麥20。外源ABA及6-BA處理顯著降低了兩品種花后28~35d旗葉MDA含量。ABA處理后,花后35d汶農(nóng)6號(hào)和濟(jì)麥20旗葉MDA含量分別降低10.9%和17.7%,而6-BA處理后兩品種分別降低26.3%和15.0%。2.4外源aba和6-ba對(duì)葉片內(nèi)源激素含量的影響2.4.1濟(jì)麥20的含量旗葉中ZR含量變化呈先降低后升高再降低的趨勢(shì),兩品種具有相同的趨勢(shì),汶農(nóng)6號(hào)旗葉中玉米素含量顯著高于濟(jì)麥20的含量(圖4-A和B)。對(duì)照處理的ZR含量在花后21d達(dá)到最高,濟(jì)麥20噴施ABA和6-BA的旗葉中ZR含量在花后28d達(dá)到最大,以后含量降低。噴施6-BA顯著提高了兩品種旗葉ZR含量,而噴施ABA降低了ZR含量,表明外源細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)內(nèi)源ZR合成,而外源ABA則抑制ZR的合成。2.4.2外源aba應(yīng)用效果在所有處理中,ABA含量呈先增高后降低的變化趨勢(shì),兩品種旗葉內(nèi)源ABA含量在花后21d達(dá)最大值,其中濟(jì)麥20含量高于汶農(nóng)6號(hào)(圖4-C和D)。外源ABA處理顯著提高了汶農(nóng)6號(hào)花后14d旗葉ABA含量,但降低了花后28~35dABA含量。噴施ABA顯著降低了濟(jì)麥20花后21~35d旗葉ABA含量。噴施外源6-BA提高了汶農(nóng)6號(hào)花后14~21d旗葉內(nèi)源ABA含量,但降低了花后28~35d旗葉ABA含量。噴施6-BA顯著降低濟(jì)麥20花后14~35d旗葉內(nèi)源ABA含量。2.4.3aba和6-ba處理對(duì)旗葉ga3含量的影響兩品種GA3含量呈雙峰變化趨勢(shì),在花后14d和21d含量相對(duì)較高。ABA和6-BA處理降低了汶農(nóng)6號(hào)花后14d旗葉GA3含量,但提高了花后28d的GA3含量。ABA和6-BA處理提高了濟(jì)麥20花后14~21d的GA3含量(圖4-E和F)。2.4.4aba對(duì)旗葉iaa含量的影響旗葉中IAA含量變化呈先升后降趨勢(shì),兩品種趨勢(shì)相同,花后21d達(dá)到最大含量。噴施ABA顯著提高了汶農(nóng)6號(hào)花后7~28d旗葉的IAA含量,其中花后21d提高26.9%。ABA處理后顯著提高濟(jì)麥20花后21~28d旗葉IAA含量,其中花后28d提高21.1%。6-BA處理提高了汶農(nóng)6號(hào)花后7~14d及提高濟(jì)麥20花后7~21d旗葉的IAA含量,但顯著降低了兩品種花后28d旗葉IAA含量,汶農(nóng)6號(hào)和濟(jì)麥20分別降低56.6%和76.7%(圖4-G和H)。2.5外源aba和6-ba對(duì)旗葉不同氧化酶活性的影響2.5.1aba和6-ba對(duì)旗葉sod活性的影響兩品種所有處理呈先降后升再降趨勢(shì),即花后7~21d降低,花后21~28d提高,花后28~35d迅速降低(圖5-A和B)。花后7~35d,汶農(nóng)6號(hào)SOD活性顯著高于濟(jì)麥20,表明在灌漿期持綠型汶農(nóng)6號(hào)能夠保持較高的清除活性氧能力。ABA和6-BA處理均能顯著提高兩品種花后旗葉SOD活性,其中花后7~21d,汶農(nóng)6號(hào)SOD活性保持較高水平,降低程度較對(duì)照有所減緩。不同激素處理在SOD活性保持上也存在一定差異,以6-BA處理的效果最好。2.5.2外源aba對(duì)旗葉pod活性的影響兩品種旗葉POD活性隨生育進(jìn)程呈先升后降的單峰曲線,于花后21d達(dá)最大值,此前保持較高水平,其后持續(xù)降低。汶農(nóng)6號(hào)POD活性高于濟(jì)麥20。外源ABA顯著提高濟(jì)麥20花后7~28d旗葉POD活性,但未引起汶農(nóng)6號(hào)旗葉POD活性的顯著變化(圖5-C和D);6-BA處理顯著提高了汶農(nóng)6號(hào)和濟(jì)麥20花后7~35d旗葉POD活性,花后21d分別提高18.5%和51.1%。2.5.3花后21d在d兩品種旗葉CAT活性隨生育進(jìn)程總體呈降低趨勢(shì),花后7~21d保持較高水平,而花后21d迅速降低。外源6-BA處理顯著提高兩品種花后7~21d旗葉的CAT活性,而外源ABA處理對(duì)旗葉CAT活性的影響未達(dá)到顯著水平(圖5-E和F)。2.6aba和6-ba處理的高產(chǎn)植物種和產(chǎn)量對(duì)照條件下汶農(nóng)6號(hào)的千粒重和產(chǎn)量均顯著大于濟(jì)麥20,表明持綠型品種產(chǎn)量較高;葉面噴施ABA和6-BA顯著提高了兩品種的千粒重和產(chǎn)量,且ABA處理汶農(nóng)6號(hào)的增產(chǎn)幅度明顯大于濟(jì)麥20,ABA和6-BA處理后汶農(nóng)6號(hào)增產(chǎn)14.1%和6.2%,而濟(jì)麥20僅增產(chǎn)5.3%和3.1%。ABA處理的增產(chǎn)效果好于6-BA處理。汶農(nóng)6號(hào)對(duì)照處理的穗數(shù)顯著低于濟(jì)麥20,但汶農(nóng)6號(hào)的穗粒數(shù)大于濟(jì)麥20,ABA和6-BA處理后穗數(shù)、穗粒數(shù)沒(méi)有顯著差異(表1)。3aba和6-ba對(duì)生態(tài)酶活性的影響持綠型品種汶農(nóng)6號(hào)的旗葉SOD、POD活性及葉綠素含量均顯著高于非持綠型品種濟(jì)麥20,而前者M(jìn)DA含量低于后者,尤其灌漿后期汶農(nóng)6號(hào)葉綠素保持較高水平,因而前者能夠產(chǎn)生更多的光合產(chǎn)物,最終獲得較高的粒重和產(chǎn)量(表1)。這與薛暉等的試驗(yàn)結(jié)果一致,即持綠型品種抗氧化能力較強(qiáng),衰老延遲。葉片衰老是一種復(fù)雜的生理生化代謝過(guò)程,通常以葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、MDA含量以及SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨生育進(jìn)程,兩品種旗葉的葉綠素含量呈降低趨勢(shì),外源ABA及6-BA處理后葉綠素在灌漿前期(花后7~21d)保持較高水平,延緩葉綠素降解(圖1)。研究表明,外源ABA能夠誘導(dǎo)干旱脅迫下psbA基因轉(zhuǎn)錄加快PSII的D1蛋白的合成,而D1蛋白周轉(zhuǎn)是保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的關(guān)鍵;外源6-BA處理能夠維持葉綠體和基粒結(jié)構(gòu)、形態(tài)的穩(wěn)定,這表明外源ABA和6-BA均能維持葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,延緩葉綠素的降解。蛋白質(zhì)是體內(nèi)的重要組成成分,蛋白質(zhì)降解是葉片衰老的基本特征之一?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的下降是蛋白酶活性升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水解加劇引起的。本試驗(yàn)中外源ABA顯著提高兩品種花后28~35d可溶性蛋白質(zhì)含量,6-BA顯著提高汶農(nóng)6號(hào)花后21~35d以及濟(jì)麥20花后7~35d旗葉的可溶性蛋白含量,可能是由于ABA和6-BA降低了蛋白酶活性。葉片衰老過(guò)程中,活性氧含量增加,膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA。植物體內(nèi)有多種途徑清除活性氧自由基,其中酶促系統(tǒng)中的SOD、POD、CAT等保護(hù)酶有關(guān)鍵作用,維持抗氧化酶較高活性可以延緩葉片衰老。本試驗(yàn)中ABA較低的濃度(10mgL-1)處理,即可誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2,H2O2能作為第二信使誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)酶基因的表達(dá)及抗氧化防護(hù)酶活性的增高。也有研究顯示外源ABA能直接誘導(dǎo)植物抗氧化防護(hù)酶基因的表達(dá),提高玉米葉片細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)酶SOD和APX的活性。細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在植物抗氧化延緩衰老中已有研究報(bào)道,有人認(rèn)為6-BA能減緩葉片中SOD活性的下降和MDA的積累,減輕細(xì)胞膜的損傷,也有人認(rèn)為細(xì)胞分裂素類物質(zhì)可直接清除氧自由基。本試驗(yàn)中外源ABA和6-BA顯著提高了兩品種旗葉的SOD活性(圖5)。外源ABA對(duì)汶農(nóng)6號(hào)POD、CAT活性影響沒(méi)有達(dá)到顯著性水平,但顯著提高了濟(jì)麥20花后7~28d的POD活性,而外源6-BA處理提高了兩品種7~28d的POD和CAT活性,表明不同品種抗氧化酶活性對(duì)不同外源激素的響應(yīng)有所差異,也表明外源ABA和6-BA能不同程度提高抗氧化酶活性,提高清除活性氧自由基能力,顯著降低兩品種花后28~35d的旗葉MDA含量(圖3),降低膜脂過(guò)氧化程度。植物葉片衰老時(shí)激素水平發(fā)生改變。外源激素通過(guò)改變內(nèi)源激素水平調(diào)節(jié)植物內(nèi)在生理代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)延緩葉片衰老與其能抑制該過(guò)程中蛋白質(zhì)水解酶和RNase活性上升、減緩蛋白質(zhì)和核酸降解有關(guān)。有研究表明提高生育期IAA、ZR、GA3含量,能提高植株的生理活性,推遲急速衰老期的出現(xiàn)。CTK通過(guò)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)而影響植物的抗性和衰老。與衰老和逆境相關(guān)的基因大多被IAA所抑制。GA3