抗氧化功能評(píng)價(jià)方法

抗氧化功能評(píng)價(jià)方法------------------------------------------------------------------------------------------------抗氧化功能評(píng)價(jià)方法附件1:試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1試驗(yàn)項(xiàng)目1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1.1體重1.1.2脂質(zhì)氧化產(chǎn)物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.1.3蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物:蛋白質(zhì)羰基1.1.4抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1.1.5抗氧化物質(zhì):還原性谷胱甘肽1.2人體試食試驗(yàn)1.2.1脂質(zhì)氧化產(chǎn)物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)1.2.2超氧化物歧化酶1.2.3谷胱甘肽過(guò)氧化物酶2試驗(yàn)原則2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試食試驗(yàn)所列的指標(biāo)均為必測(cè)項(xiàng)目。2.2脂質(zhì)氧化產(chǎn)物指標(biāo)中丙二醛和血清8-表氫氧異前列腺素任選其一進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抗氧化酶指標(biāo)中超氧化物歧化酶和谷——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------胱甘肽過(guò)氧化物酶任選其一進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。2.3氧化損傷模型動(dòng)物和老齡動(dòng)物任選其一進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。2.4在進(jìn)行人體試食試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)對(duì)受試樣品的食用安全性作進(jìn)一步的觀察。3結(jié)果判定3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn):脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)四項(xiàng)指標(biāo)中三項(xiàng)陽(yáng)性，可判定該受試樣品抗氧化功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。3.2人體試食試驗(yàn):脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶三項(xiàng)指標(biāo)中二項(xiàng)陽(yáng)性，且對(duì)機(jī)體健康無(wú)影響，可判定該受試樣品具有抗氧化功能的作用。1抗氧化功能檢驗(yàn)方法MethodfortheAssessmentofAntioxidativeFunction1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠，也可用氧化損傷模型鼠。單一性別，小鼠每組10,15只，大鼠8,12只。1.2劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)溶劑對(duì)照組，以人體推薦量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，高劑量一般不超過(guò)30倍，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天?！?-----------------------------------------------------------------------------------------------1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1老齡動(dòng)物選用10月齡以上大鼠或8月齡以上小鼠，按血中MDA水平分組，隨機(jī)分為1個(gè)溶劑對(duì)照組和3個(gè)受試樣品劑量組。3個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，對(duì)照組給予同體積溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2D,半乳糖氧化損傷模型1.3.2.1原理D-半乳糖供給過(guò)量，超常產(chǎn)生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起過(guò)氧化效應(yīng)。1.3.2.2造模方法選25-30g健康成年小鼠，除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物用D-半乳糖40mg,1.2g/kgBW頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為0.1mL/10g，每日1次，連續(xù)造模6周，取血測(cè)MDA，按MDA水平分組。隨機(jī)分為1個(gè)模型對(duì)照組和3個(gè)受試樣品劑量組，3個(gè)劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶劑，在給受試樣品的同時(shí)，模型對(duì)照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3乙醇氧化損傷模型1.3.3.1原理——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------2乙醇大量攝入，激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞過(guò)氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原性谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2造模方法選25,30g健康成年小鼠(180,220g大鼠)，隨機(jī)分為4個(gè)組，1個(gè)模型對(duì)照組和3個(gè)受試樣品劑量組，必要時(shí)可增設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。3個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30天，末次灌胃后，模型組對(duì)照組和3個(gè)劑量組禁食16小時(shí)(過(guò)夜)，然后1次性灌胃給予50%乙醇12ml/kgBW，6小時(shí)后取材(空白對(duì)照組不作處理，不禁食取材)，測(cè)血清或肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定1.3.4.1血中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量測(cè)定血中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量可采用熒光法和比色法測(cè)定，方法任選其一。1.3.4.1.1熒光法1.3.4.1.1.1熒光法原理MDA(malondiadehycle)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，測(cè)其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。1個(gè)丙二醛(MDA)分子與2個(gè)硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。以波長(zhǎng)536nm為激發(fā)光，在550nm有最強(qiáng)熒光強(qiáng)度?？捎脽晒夥ㄟM(jìn)行微量測(cè)定。——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.3.4.1.1.2儀器與試劑儀器:熒光分光光度計(jì)、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管試劑:10mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液，棕色瓶4?保存12個(gè)月)，臨用前用純水稀釋成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸EDTA.2H200.209g25mg1mg谷胱甘肽(還原型)酸水解液0.1mol/LH2SO40.1mol/LNa2SO4正丁醇用0.02mol/LNaOH50mL溶解(微溫助溶，棕色瓶4?保存2周)125mL125mL加水150mL用H2SO4調(diào)pH1.5，加水稀釋至500mL以上所用玻璃器皿均需經(jīng)50,硝酸浸泡24h后，再經(jīng)蒸餾水、雙蒸水淋洗干燥，試劑3(選AR級(jí))最好用雙蒸水配制。1.3.4.1.1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.1.1.3.1樣品制備——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------全血上清液:取血50μl加入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。血清樣品:取血0.5mL室溫靜置10min，2000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。1.3.4.1.1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將10nmol/mL四乙氧基丙烷，用雙蒸水稀釋成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分別取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL?混勻，避光、沸水浴60min?流水冷卻至室溫?3mL正丁醇振蕩抽提1min?3000r/min離心5min?取上清液(正丁醇層)測(cè)熒光強(qiáng)度(入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長(zhǎng)536nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm)以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。1.3.4.1.1.3.3樣品測(cè)定試劑10mL具塞離心管酸水解液TBA工作液正丁醇空白管0.1mL蒸餾水2mL0.5mL3mL樣本管0.1mL血清*2mL0.5mL3mL標(biāo)準(zhǔn)管0.1mL標(biāo)準(zhǔn),2mL0.5mL3mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻振蕩抽提1min，3000r/min離心5min*全血上清液0.5mL(空白管加蒸餾水0.5mL，標(biāo)準(zhǔn)管加標(biāo)準(zhǔn)0.1mL、蒸餾水0.4mL),1nmol/mL四乙氧基丙烷(標(biāo)準(zhǔn))——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------血清0.1mL(或全血上清液0.5mL)?加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL?混勻，避光、沸水浴60min?流水冷卻至室溫?3mL正丁醇振蕩抽提1min?3000r/min離心5min?取上清液(正丁醇層)測(cè)熒光強(qiáng)度(入射狹縫1.5nm，出射狹縫5nm，激發(fā)波長(zhǎng)536nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm)1.3.4.1.1.3.4計(jì)算公式:B-AB-A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血清),———×C×K=————×1×1F-AF-AB-AB-A1過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血液),———×C×K=———×1×————F-AF-A0.05A:空白管熒光度B:樣品熒光度F:四乙氧基丙烷熒光度C:四乙氧基丙烷濃度(1nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)41.3.4.1.2比色法1.3.4.1.2.1比色法原理MDA(malondiadehycle)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，測(cè)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。1個(gè)丙二醛(MDA)分子與2個(gè)硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長(zhǎng)532nm有極大吸收峰?？捎梅止夤夥ㄟM(jìn)行測(cè)定。1.3.4.1.2.2儀器與試劑儀器:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管。試劑:0.2M乙酸鹽緩沖液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸鈉溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液，4?保存3個(gè)月)，臨用前用水稀釋成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸鹽緩沖液pH7.40.2M磷酸氫二鈉1920mL0.2M磷酸二氫鉀480mL1.3.4.1.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.1.2.3.1樣品制備溶血液樣品:取血20μL加入0.98mL蒸餾水制成2,溶血液。1.3.4.1.2.3.2樣品測(cè)定試劑2,溶血液*40nmol/mL四乙氧基丙烷8.1%SDS0.2M乙酸鹽緩沖液0.8%TBAH2O空白管0.2mL1.5mL1.5mL0.8mL樣品管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.6mL標(biāo)準(zhǔn)管——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.6mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。*若用血清，樣品管0.15mL，標(biāo)準(zhǔn)管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3計(jì)算B–AB–A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL2%溶血液),————×C×K=—————×40×1F–AF–AB–AB–A過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/mL血清),————×C×K=—————×40×1F–AF–A5A:空白管吸光度B:樣品吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.2組織中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量測(cè)定1.3.4.2.1原理見(jiàn)1.3.4.1.2.11.3.4.2.2儀器與試劑儀器:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器試劑:見(jiàn)1.3.4.1.2.21.3.4.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.2.3.1樣品制備——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------組織勻漿樣品:取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成10,組織勻漿(W/V)，3000r/min離心5,10min，取上清液待測(cè)。1.3.4.2.3.2樣品測(cè)定試劑10,組織勻漿40nmol/mL四乙氧基丙烷8.1%SDS0.2M乙酸鹽緩沖液0.8%TBAH2O空白管0.2mL1.5mL1.5mL0.8mL樣品管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.7mL標(biāo)準(zhǔn)管0.2mL0.2mL1.5mL1.5mL0.7mL混勻，避光沸水浴60min，流水冷卻，于532nm比色注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行1.3.4.2.3.3計(jì)算B-AB-A1過(guò)氧化脂質(zhì)含量,————×C×K=———×40×————————(nmol/mg組織)F-AF-A0.2×10%×1000A:空白管吸光度B:樣品管吸光度F:四乙氧基丙烷吸光度C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)K:稀釋倍數(shù)1.3.4.3血清中8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)測(cè)定——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.3.4.3.1原理68-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)是體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激反應(yīng)穩(wěn)定而具有特異性的標(biāo)志物，其含量能間接反應(yīng)因機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而導(dǎo)致組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化程度。1.3.4.3.2儀器與試劑儀器:酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機(jī)試劑:8-IsoprostaneKIAKit(酶聯(lián)免疫試劑盒)8-IsoprostaneEIA抗體血清、8-IsoprostaneAChE示蹤物、8-IsoprostaneEIA標(biāo)準(zhǔn)品、EIA緩沖液、洗滌緩沖液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman’s試劑1.3.4.3.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.4.3.3.1樣品制備小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血，3000r/min離心10min。取上清液，用EIA緩沖液稀釋15倍備用。1.3.4.3.3.2樣品測(cè)定按試劑盒說(shuō)明操作。8-表氫氧異前列腺素標(biāo)準(zhǔn)孔濃度分別為:500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12.8pg/mL、5.1pg/mL、2.0pg/mL、0.8pg/mL標(biāo)準(zhǔn)或樣品孔吸光度—NSB孔吸光度%B/B0=——————————————————×100B0孔吸光度—NSB孔吸光度以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度的對(duì)數(shù)(log)為橫坐標(biāo)，%B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，亦可將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]做為縱坐——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。將樣品的%B/B0值，代入方程式，計(jì)算出樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中的8-表氫氧異前列腺素濃度。1.3.5蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定H2O2或O2?ˉ自由基對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈，使肽鏈斷裂，引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋7白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)羰基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度。蛋白質(zhì)羰基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過(guò)程中的早期標(biāo)志，它隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。1.3.5.1血清中蛋白質(zhì)羰基測(cè)定1.3.5.1.1原理被氧化后的蛋白質(zhì)羰基含量增多，羰基可與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙，2，4(二硝基苯腙為紅棕色的沉淀，將沉淀用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計(jì)上讀取370nm下的吸光度值，從而測(cè)定蛋白質(zhì)的羰基含量。1.3.5.1.2儀器與試劑儀器:紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、混旋器、2ml離心管。試劑:10mmol/L2，4-二硝基苯肼(DNPH)99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4?避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無(wú)水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.1.3操作步驟渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調(diào)零，測(cè)定OD值。用雙縮脲法測(cè)定血清(或血漿)蛋白質(zhì)含量。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。81.3.5.1.4計(jì)算公式測(cè)定管OD-對(duì)照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot)22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)1.3.5.2組織中蛋白質(zhì)羰基測(cè)定1.3.5.2.1原理見(jiàn)1.3.5.1.11.3.5.2.2儀器與試劑儀器:紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微量加樣器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、天平、勻漿器、低溫高速離心機(jī)、混旋器、2ml離心管。試劑:10mmol/LHEPES緩沖液pH7.42.38克N-2-羥乙基哌嗪-2’-乙磺酸(HEPES)溶入1000ml雙蒸——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------餾水，用lNNaOH調(diào)pH至7.4，4?保存。100g/L硫酸鏈霉素1g硫酸鏈霉素，溶入10ml雙蒸餾水，4?避光保存。10mmol/L2，4-二硝基苯肼(DNPH)99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml2mol/LHCL溶解，4?避光保存。2mol/LHCL200g/L三氯乙酸(TCA)6mol/L鹽酸胍無(wú)水乙醇乙酸乙酯混合應(yīng)用液將無(wú)水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3.5.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.5.2.3.1樣品處理取0.1g組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加人0.9ml的冰的10mmol/LHEPES緩沖液(pH7.4)，制成10,的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min，保留上清。取100g,L的硫酸鏈霉素溶液50μl，加入上清液450μl(v/v,1:9)，室溫放置10min后，以11000r/min的轉(zhuǎn)速，離心10min，取上清液待測(cè)。9渦旋混勻，將全部沉淀溶解，以12000r/min離心15min，取上清液在370nm處比色，6mol/L鹽酸胍試劑調(diào)零，測(cè)定OD值。用雙縮——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------脲法測(cè)定勻漿上清液蛋白質(zhì)含量。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.5.2.3.3計(jì)算公式測(cè)定管OD-對(duì)照管OD蛋白質(zhì)羰基含量=——————————————————————×125×105(nmol/mgprot)22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)1.3.5.3注意事項(xiàng)1.3.5.3.1加入硫酸鏈霉素:在勻漿上清液中加人硫酸鏈霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些堿基如鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，這些堿基就會(huì)與DNPH結(jié)合，并反應(yīng)生成有色物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)增加最后溶液的吸光度，使結(jié)果偏大。1.3.5.3.2DHPH的溶解:DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀堿等溶液，因此，用2mol,LHC1來(lái)溶解DNPH。設(shè)對(duì)照管是為了避免HC1與反應(yīng)液中一些物質(zhì)反應(yīng)生成對(duì)比色有影響的物質(zhì)。1.3.5.3.3反應(yīng)體系應(yīng)避光:當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中加人DNPH進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系需置于黑暗中，因?yàn)镈NPH不穩(wěn)定，見(jiàn)光會(huì)分解。如果反應(yīng)體系遇到光，DNPH分解，體系中會(huì)有剩余的沒(méi)有變成蛋白質(zhì)腙衍生物，對(duì)反應(yīng)比色有影響。1.3.5.3.4去除未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH:由于DNPH在370nm左右有強(qiáng)烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反復(fù)洗滌沉淀，去——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------掉未與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNPH，否則，會(huì)增加吸光值。1.3.6抗氧化酶活力測(cè)定SOD催化超氧陰離子自由基(O2?ˉ)生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和過(guò)氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除O2?ˉ對(duì)細(xì)胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動(dòng)物某些器官和人體血紅細(xì)胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長(zhǎng)成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。1.3.6.1血或組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定1.3.6.1.1原理O2?ˉ氧化羥胺的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對(duì)氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長(zhǎng)530nm處有極大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)SOD消除O2?ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。1.3.6.1.2儀器與試劑儀器可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫水浴、勻漿器試劑65mM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.81010mmol/L鹽酸羥胺鹽酸羥胺6.95mg，加PBS至10mL7.5mmol/L黃嘌呤黃嘌呤11.41mg，加0.1MNaOH2.5mL溶解，加PBS至10mL0.2g/L黃嘌呤氧化酶取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS9.8mL至10mL——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.1%甲萘胺取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸餾水，涼至室溫加50mL冰醋酸，再加110mL涼蒸餾水至200mL0.33%對(duì)氨基苯磺酸取0.66g對(duì)氨基苯磺酸溶于150mL溫蒸餾水，加50mL冰醋酸至200mLSOD標(biāo)準(zhǔn)品三氯甲烷95,乙醇(v/v)0.9%生理鹽水1.3.6.1.3實(shí)驗(yàn)步驟紅細(xì)胞抽提液制備:10μl全血沖入0.5mL生理鹽水，2000r/min離心3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻，加入95,乙醇0.1mL，振蕩30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min離心3min，分層，上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測(cè)。組織勻漿的制備:剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行三次，制成1,組織勻漿，(最好用超聲波發(fā)生器處理30s)，使線粒體振破，以中性紅,詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min，取上清液20μl待測(cè)。SOD標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線將SOD標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸鹽緩沖液配制成——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------750U/mL的溶液，再稀釋到50倍，即SOD量為15U/mL(1.5μg/mL)，用本法測(cè)定不同量的SOD標(biāo)準(zhǔn)液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標(biāo)，以SOD活力單位U/mL為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照管OD,測(cè)定管ODSOD百分抑制率,??????????????×100,對(duì)照管OD計(jì)算每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50,時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)單位。100,對(duì)照管OD反應(yīng)液總量(6mL)SOD活力(U/mL),?????????×??????????×樣品稀釋倍數(shù)50,取液量也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的SODU/mL，乘以稀釋倍數(shù)(1mL/取樣量)。若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細(xì)胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/gHb。11樣品測(cè)定步驟:試劑1/15mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.8(mL)樣品——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------10mmol/L鹽酸羥胺(mL)7.5mmol/L黃嘌呤(mL)0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶(mL)雙蒸水(mL)測(cè)定管1.0A*0.10.20.20.49混勻，37?恒溫水浴30min0.33%對(duì)氨基苯磺酸(mL)0.1%甲萘胺(mL)*A所用樣品的量紅細(xì)胞抽提液血清(或血漿)1%組織勻漿10μl20,30μl(溶血樣品剔除)10,40μl對(duì)照管1.00.10.20.20.492.02.02.02.0混勻15min后，倒入1cm光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm處比色測(cè)定OD值。注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.6.2血或組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH,Px)活力測(cè)定1.3.6.2.1原理谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對(duì)防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來(lái)表示，GSH和5,5’-二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長(zhǎng)有——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。1.3.6.2.2試劑和儀器儀器:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑:疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCL、NaOH調(diào)pH7.0，4?保存。1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1,2日。1.25,1.5mmol/LH2O2溶液取30,H2O20.15,0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4?避光保存，臨12用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液HPO3EDTANaCl——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------0.32mol/LNa2HPO4溶液:Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB檸檬酸三鈉0.2M磷酸緩沖液pH7.40.9%生理鹽水1.3.6.2.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.6.2.3.1樣品制備溶血液:取鼠血10μl加入到1mL雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血1:100待測(cè)，4h內(nèi)測(cè)定酶活力。若當(dāng)天來(lái)不及測(cè)定，將肝素抗凝全血置-20?凍存，3d內(nèi)測(cè)定，若4?存放，28h內(nèi)必須測(cè)完。測(cè)前取出樣品室溫自然解凍。組織上清液:動(dòng)物禁食過(guò)夜，處死后，立即取出所需臟器，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎塊，稱取適量組織，加冷0.2M磷酸緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)3次制成5%組織勻漿，操作在冰浴中進(jìn)行，勻漿以12500×g離心10min(低溫高速離心機(jī))，以沉淀為破碎的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、核及線粒體，上清液用以測(cè)胞液中的酶活力，最好當(dāng)天測(cè)，否則加20,(v/v)甘油分裝于塑料管，放置-20,-80?，可保存數(shù)周，而酶活力不減。1.3.6.2.3.2GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑8mL，用雙蒸水稀釋至10mL刻度，即得到濃度為0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液。取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液各2mL，放入試管中，加入0.32mol/LNa2HPO42.5mL，比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯，5min內(nèi)在可見(jiàn)光423nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，以雙蒸水調(diào)零點(diǎn)。以GSH含量(μmol/L)為橫坐標(biāo)，OD423值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.6.2.3.3測(cè)定步驟:試劑1.0mmol/LGSH樣品**雙蒸水*樣品管(mL)0.40.4非酶管(mL)0.40.4空白管(mL)40mg1.0g16.7g(先用蒸餾水溶解)0.5g280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過(guò)濾，室溫保存。加蒸餾水至100mL，4?避光保存1個(gè)月。1337?水浴預(yù)溫5minH2O2(37?預(yù)熱)偏磷酸沉淀液0.20.2——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------37?水浴準(zhǔn)確反應(yīng)3min(嚴(yán)格控制時(shí)間)43000r/min離心10min離心上清液雙蒸水偏磷酸沉淀液0.32mol/LNa2HPO4DTNB顯色液22.50.522.50.50.41.62.50.54顯色反應(yīng)1min后于423nm波長(zhǎng)(1cm光徑)，讀OD值，5min之內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。*樣品為組織上清液時(shí)，非酶管改為加熱使酶失活的組織上清液。**溶血液0.1,0.4mL組織上清液1:20稀釋，取稀釋液0.4mL注:如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.6.2.3.4計(jì)算鼠全血GSH-Px活力單位規(guī)定每1mL全血，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1為一個(gè)酶活力單位。非酶管log[GSH]-樣品管log[GSH]鼠全血GSH-Px活力單位(U/mL全血)=????????????????3min×0.004mL——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------log[非酶管OD,空白管OD]-log[樣品管OD-空白管OD]=????????????????????????3min×0.004mL組織GSH-Px比活力單位規(guī)定每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘，扣除非酶反應(yīng)，使GSH濃度降低1μmol/L為一個(gè)酶活力單位。(非酶管OD,樣品管OD)×A**×5組織GSH-Px比活力單位(U/mg蛋白)=???????????????????3min×樣品蛋白質(zhì)的mg數(shù)**Folin法或雙縮脲法測(cè)樣品蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)GSH濃度(μmol/L)**A=???????????即標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。標(biāo)準(zhǔn)GSH光密度(OD)1.3.6.2.4注意事項(xiàng)1.3.6.2.4.1由于H2O2易分解導(dǎo)致濃度改變，臨用時(shí)取貯備液用分光光度計(jì)測(cè)其濃度，取貯備液3mL，測(cè)定1cm光徑的240nm處OD值。OD濃度(mmol/L),————————0.036(消光系數(shù))若OD值為0.45，則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。1.3.6.2.4.25-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個(gè)反應(yīng)體系中氫離子濃度有關(guān)，還——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------14受反應(yīng)時(shí)間限制。加入顯色劑后，反應(yīng)體系pH為6.5時(shí)，11min開始顯色，此時(shí)比色5min內(nèi)讀數(shù)準(zhǔn)確。1.3.7抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定谷胱甘肽是一種低分子清除劑，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，是GSH-PX和GST兩種酶類的底物，為這兩種酶分解氫過(guò)氧化物所必需，它能穩(wěn)定含巰基的酶，和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭GSH會(huì)促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用，GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。1.3.7.1血或組織中還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定方法1.3.7.1.1原理GSH-和5，5'-二硫?qū)ο趸姿?DTNB)反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于420nm波長(zhǎng)有最吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算GSH的含量。1.3.7.1.2儀器和試劑儀器:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、低溫高速離心機(jī)、勻漿器、恒溫水浴鍋、微量加樣器試劑:0.9,生理鹽水4,磺基水楊酸溶液0.1mol/LPBS溶液(pH=8.0):——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------稱取Na2HPO413.452g，KH2PO40.722g，加蒸餾水至1000mL。0.004,DTNB溶液:稱取DTNB40mg溶于1000mL的0.1mol/LPBS溶液(pH=8.0)中。疊氮納緩沖液:NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0，4?保存。標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取還原型GSH15.4mg，加疊氮納緩沖液至50mL，終濃度為1mmol/L，臨用前配制。1.3.7.1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.7.1.3.1樣品制備:溶血液上清液:取0.1mL抗凝全血加雙蒸水0.9mL(1:9溶血液)，充分混勻，直至透亮為止。取溶血液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。血清上清液:取0.1mL血清加4%磺基水楊酸0.1mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。組織上清液:取組織0.5g加生理鹽水4.5mL充分研磨成細(xì)漿(10%肝勻漿)，混勻后取15——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500rpm離心10分鐘，取上清液備用。1.3.7.1.3.2樣品測(cè)定:溶血液或組織樣品測(cè)定:上清液4%磺基水楊酸DTNB血清樣品測(cè)定:上清液4%磺基水楊酸DTNB測(cè)定管0.1mL,0.9mL空白管,0.1mL0.9mL測(cè)定管0.5mL,4.5mL空白管,0.5mL4.5mL混勻，室溫放置10分鐘后，420nm處測(cè)定吸光度?；靹颍覝胤胖?0分鐘后，420nm處測(cè)定吸光度。注:該指標(biāo)檢測(cè)，需新鮮樣品取材后當(dāng)天完成。用雙縮脲法測(cè)定血清(或溶血液)、組織勻漿蛋白質(zhì)含量。如用試劑盒，可按試劑盒的操作要求進(jìn)行。1.3.7.1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線取1mmol/LGSH標(biāo)準(zhǔn)溶液0、10、20、50、100、150、200μL,分別加入生理鹽水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液系列，各管加入DTNB4.5mL，混勻，室溫放置10分鐘后，空白管調(diào)零，420nm處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1mmol/LGSH(mL)生理鹽水(mL)DTNB(mL)GSH量(?mol/L)1.3.7.1.3.4計(jì)算樣品GSH含量=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×溶血液稀釋倍數(shù)×上清液稀釋倍數(shù)(?mol/L全血)=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×10×2樣品GSH含量=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)(?mol/L血清)=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×2樣品GSH含量=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)?上清液組織含量(?mol/g組織)=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×2?100g組織/L樣品GSH含量=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×上清液稀釋倍數(shù)?上清液蛋白含量(?mol/gprot)=對(duì)應(yīng)曲線濃度值(?mol/L)×2?勻漿gprot/L16100.504.50020.010.494.502030.020.484.504040.050.454.5010050.100.404.5020060.150.354.5030070.200.304.504001.4數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------1.4.1數(shù)據(jù)處理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論:各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性;F值?F0.05，P?0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。1.4.2指標(biāo)判定1.4.2.1脂質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型(或老齡)對(duì)照組比較，過(guò)氧化脂質(zhì)(丙二醛或8-表氫氧異前列腺素)含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。1.4.2.2蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物受試樣品組與模型(或老齡)對(duì)照組比較，蛋白質(zhì)羰基含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有降低蛋白質(zhì)過(guò)氧化作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。1.4.2.3抗氧化酶活力受試樣品組與模型(或老齡)對(duì)照組比較，抗氧化酶(SOD或GSH-PX)活力升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化酶活力作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。1.4.2.4抗氧化物質(zhì)GSH受試樣品組與模型(或老齡)對(duì)照組比較，GSH含量升高有統(tǒng)計(jì)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------學(xué)意義，判定該受試樣品有升高抗氧化物質(zhì)GSH作用，該項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。1.4.3結(jié)果判定過(guò)氧化脂質(zhì)含量、蛋白質(zhì)羰基、抗氧化酶活性、還原性谷胱甘肽四項(xiàng)指標(biāo)中三項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，可判定該受試樣品抗氧化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。2人體試食試驗(yàn)2.1受試者納入標(biāo)準(zhǔn)選年齡在18,65歲，身體健康狀況良好，無(wú)明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患，無(wú)長(zhǎng)期服藥史，志愿受試保證配合的人群。2.2排除受試者標(biāo)準(zhǔn)2.2.1妊娠或哺乳期婦女，對(duì)保健食品過(guò)敏者。2.2.2合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病患者。2.2.3短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對(duì)結(jié)果的判斷者。2.2.4不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定食用受試樣品，無(wú)法判定功效或資料不全影響功效或安全17性判斷者。2.3受試者分組對(duì)受試者按MDA、SOD、GSH-Px水平隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習(xí)慣等，進(jìn)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.4試驗(yàn)方法采用自身和組間兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。試驗(yàn)組按推薦服用方法、服用量每日服用受試產(chǎn)品，對(duì)照組可服用安慰劑或采用陰性對(duì)照。受試樣品給予時(shí)間3個(gè)月，必要時(shí)可延長(zhǎng)至6個(gè)月。試驗(yàn)期間對(duì)照組和試食組原生活、飲食不變。2.5觀察指標(biāo)各項(xiàng)指標(biāo)在試驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)各檢測(cè)1次。2.5.1安全性指標(biāo)2.5.1.1一般狀況包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.5.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.5.1.3肝、腎功能檢查2.5.1.4胸透、心電圖、腹部B超檢查2.5.2功效指標(biāo)2.5.2.1過(guò)氧化脂質(zhì)含量觀察試驗(yàn)前后MDA的變化及MDA下降百分率。(測(cè)定方法見(jiàn)1.3.3.1)試驗(yàn)前MDA—試驗(yàn)后MDAMDA下降百分率=?100%試驗(yàn)前MDA觀察試驗(yàn)前后8-Isoprostane的變化及8-Isoprostane下降百分率。(測(cè)定方法見(jiàn)2.8)——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------試驗(yàn)前8-Isoprostane—試驗(yàn)后8-Isoprostane8-Isoprostane下降百分率=?100%試驗(yàn)前8-Isoprostane2.5.2.2超氧化物歧化酶觀察試驗(yàn)前后SOD的變化及SOD升高百分率。(測(cè)定方法見(jiàn)1.3.4.1)試驗(yàn)前SOD—試驗(yàn)后SODSOD升高百分率=?100%試驗(yàn)前SOD2.5.2.3谷胱甘肽過(guò)氧化物酶觀察試驗(yàn)前后GSH,PX的變化及GSH,PX升高百分率。(測(cè)定方法見(jiàn)2.7)18試驗(yàn)前GSH,PX—試驗(yàn)后GSH,PXGSH,PX升高百分率=×100%試驗(yàn)前GSH,PX2.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定凡自身對(duì)照資料可以采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，后者需進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn);若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用t’檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn);但變異系數(shù)太大(如CV>50,)的資料應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。在試驗(yàn)前組間比較差異無(wú)顯著性的前提下，可進(jìn)行試驗(yàn)后組間比較?！?-----------------------------------------------------------------------------------------------各功效觀察指標(biāo)試驗(yàn)前后自身比較和試食后組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方可判定該指標(biāo)陽(yáng)性。過(guò)氧化脂質(zhì)含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有抗氧化功能作用。2.7血中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH,Px)活力測(cè)定2.7.1原理谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對(duì)防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化特別重要，其活力以催化GSH氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來(lái)表示，GSH和5，5’-二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子，于423nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算出GSH減少的量，由于GSH能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。2.7.2試劑和儀器儀器:可見(jiàn)光分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、微量加樣器、離心機(jī)試劑:疊氮鈉磷酸緩沖液pH7.0NaN3EDTA-Na2Na2HPO4NaH2PO416.25mg7.44mg1.732g1.076g終濃度2.5mmol/L終濃——————————————————————————————————————------------------------------------------------------------------------------------------------度0.2mmol/L終濃度0.2mol/L終濃度0.2mol/L加蒸餾水至100mL，用少量HCL、NaOH調(diào)pH7.0，4?保存。1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液GSH30.7mg加疊氮鈉磷酸緩沖液至100mL，臨用前配制，冰凍保存1,2日。1.25,1.5mmol/LH2O2溶液取30,H2O20.15,0.17mL，用雙蒸水稀釋至100mL，作為貯備液，4?避光保存，臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。偏磷酸沉淀液19HPO3EDTANaCl0.32mol/LNa2HPO4溶液:16.7g(先用蒸餾水溶解)0.5g280g加蒸餾水至1000mL，用普通濾紙過(guò)濾，室溫保存。Na2HPO422.7g加蒸餾水至500mL，室溫保存。DTNB顯色液DTNB檸檬酸三鈉40mg1.0g加蒸餾水至100mL，4?避光保存1個(gè)月。2.7.3實(shí)驗(yàn)步驟2.7.3.1樣品制備溶血液:取血20μ