長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分

長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分李明潔;楊波;趙建新;張灝;陳衛(wèi)【期刊名稱】《《食品與發(fā)酵工業(yè)》》【年(卷)，期】2019(045)018【總頁數(shù)】7頁(P43-49)【關(guān)鍵詞】長雙歧桿菌;亞種;區(qū)分;碳水化合物利用;特異性基因擴(kuò)增【作者】李明潔;楊波;趙建新;張灝;陳衛(wèi)【作者單位】江南大學(xué)食品學(xué)院江蘇無錫214122【正文語種】中文長雙歧桿菌是在人體腸道微生物群中最廣泛存在的一種雙歧桿菌［1］，具有防治便秘［2］、抑制腸道致病菌［3］、調(diào)節(jié)腸道平衡、降低膽固醇［4］、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、延緩衰老［5］和增強(qiáng)機(jī)體免疫活性［6-7］等生理功能。長雙歧桿菌可分為3個(gè)亞種，即長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種和長雙歧桿菌豬亞種［8］，這3個(gè)亞種在生理生化特性以及遺傳進(jìn)化方面十分相近，常用的16SrRNA菌種鑒定的方法無法實(shí)現(xiàn)這3個(gè)亞種的區(qū)分［9-10］。目前多使用全基因組測序及系統(tǒng)發(fā)育樹［11-13］、PCR-RFLP［14］、PCR-DGGE［15］、多位點(diǎn)序列分析(MLSA)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)［16］、多位點(diǎn)測序分型(MLST)［17］等方法來區(qū)分不同亞種，但這些方法過程復(fù)雜，耗時(shí)長，成本高?！恫苁舷到y(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》中記錄了長雙歧桿菌的不同亞種對(duì)碳水化合物利用能力存在顯著差異，這或許可作為區(qū)分不同亞種的依據(jù)。此外，利用基因型差異來區(qū)分亞種的方法也更加可靠，已有研究者嘗試采用特異性基因擴(kuò)增的方法進(jìn)行一些細(xì)菌的亞種區(qū)分，該方法過程簡單、快速，但需要找到能夠可靠區(qū)分不同亞種的特異性基因［18-21］。因此，本研究擬利用碳水化合物利用譜測定、特異性基因擴(kuò)增等手段，確認(rèn)一種有效、快速、低成本的區(qū)分方法，以實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌的亞種區(qū)分。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株本文所用54株長雙歧桿菌，均保存于江南大學(xué)食品生物技術(shù)研究中心菌種庫（表1）。其中ATCC15697為長雙歧桿菌嬰兒亞種，13株已測定了基因組但亞種未知，其余40株亞種未知且無基因組序列。表1本文所用長雙歧桿菌Table1Bifidobacteriumlonguminthisstudy菌株號(hào)基因組測序菌株號(hào)基因組測序菌株號(hào)基因組測序CCFM685是FGSYC85M1否FHuNCS3M9否CCFM686是FJLHD17M1否FHuNCS6M8否CCFM752是FXJSW41R12否FZJHZ3M3否CCFM756是FXJKS50M3否FHuNCS1L4否CCFM762是FJSWX32M3否FSDWF3M1否FGZ6I1M6是FHuNMY3M4否FJND12M3否FGZ16I1M5是JSWX38M1否FFJND18M2否FHeNJZ44M8是HeNJZ8M1否FZJHZ15M2否M2-03-F02-27是FSDHZD2L8否FZJHZ16M1否ATCC15697是FBJHD2M2否FJSSZ6M3否FGZ17I1M1是NMGEL2M6否FXJWS32M1否FGZ19I1M3是FJND16M4否FHNFQ59M1否FGZ23I1M2是JSZJ4M3否FGZ13I1M1否CCFM688是JSSZ7M7否FGZ14I1M1否FHNFQ28M5否JSNJ1M4否FXJSW42R14否FXJWS41M1否FJND15M4否FXJSW50R18否FJSSZ4M2否BJCY1M3否JSYC2M1否FZJHZ4M6否FZJHZ13M3否FHNXY43M6否1.1.2培養(yǎng)基與試劑改良MRS（modifiedMRS,mMRS）培養(yǎng)基：蛋白腺10g;牛肉膏10g;酵母粉5g；葡萄糖20g；乙酸鈉5g；吐溫801mL；K2HPO42.0g;檸檬酸氫二銨2.0g；MgSO4?7H2O0.1g；MnSO4?H2O0.05g；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g；蒸餾水1L；pH6.2-6.4；115°C滅菌20min。不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基：用不同的碳水化合物（終質(zhì)量濃度為10g/L）替代mMRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，并添加0.5%漠甲酚紫母液15mL/L；作為陰性對(duì)照培養(yǎng)基：mMRS培養(yǎng)基添加0.5%漠甲酚紫母液15mL/L；2xTaqPlusMasterMix,康為世紀(jì)生物科技有限公司；GeneRulerDNALadderMix,英濰捷基；HGV-H核酸染液，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖，生工生物工程股份有限公司。1.2儀器與設(shè)備AW500SG型Electrotek厭氧工作站，英國依萊泰科；GR60DA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；C1000TouchTM型基因擴(kuò)增儀，美國Bio-Rad公司；DYCP-31DN/DYCP-32B水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GelDocTMEZimager凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。1.3方法1.3.1系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用orthomclV2.0.9軟件對(duì)不同菌株的直系同源基因進(jìn)行分析［22-23］,根據(jù)同源基因分析結(jié)果，提取所有菌株的直系同源基因序列，利用mafft-7.313軟件對(duì)不同菌株的直系同源基因進(jìn)行序列比對(duì)［22,24］，基于序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行進(jìn)化分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.3.2菌株的活化將保藏于甘油中的菌株劃線至mMRS固體培養(yǎng)基37°C厭氧培養(yǎng)48h，后挑取單菌落接種至5mLmMRS液體培養(yǎng)基中，37C厭氧培養(yǎng)48h，液體連續(xù)活化2代。1.3.3碳水化合物利用能力比較將200pL不同碳水化合物替代葡萄糖的培養(yǎng)基和陰性對(duì)照的培養(yǎng)基分裝于無菌96孔板中，分別接種2次活化后的2pL菌液至96孔中，每個(gè)菌每種碳水化合物測2個(gè)平行孔，培養(yǎng)48h后觀察孔板中培養(yǎng)基顏色變化及菌株生長情況。碳水化合物利用能力比較實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍測定。1.3.4不同亞種的特異性基因分析本文所有引物信息如表2所示。PCR反應(yīng)體系(20pL):模板1pL,上、下游引物各0.5pL,2xTaqMasterMix10pL,ddH2O8pL。PCR條件：95C預(yù)變性5min,951變性35s,601退火35s,72C延伸40s，從變性到延伸需要重復(fù)30個(gè)循環(huán)，最后72C補(bǔ)充延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀中觀察條帶情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次確保引物具有良好的重復(fù)性。表2PCR引物Table2PCRprimers亞種名稱特異性基因引物名稱序列(5'-3')片段長度/bp參考文獻(xiàn)長雙歧桿菌長亞種MarRfamilytranscriptionalregula-torMarR-FMarR-RATCCTCAACCAATGCGT-TCCGGCTTGTTCCAGCAGTTT-GA168[20]TelluriteresistanceproteinTerBTerB-FTerB-RTGAGGGTGTTGATG-CAGTCTATCGTCCGGGCAATAT-GTCT156[20]Sugarkinasegenelon_Flon_RGAGGCGATGGTCTG-GAAGTTCCACATCGCCGAGAAGAT-TC181[18]TufgeneBloFBloRGTATCCGTCCGACCCAG-CAGGGTGACGGAGCCCGGCTTG161[21]長雙歧桿菌嬰兒亞種GlyoxalaseGlyoxalase-FGlyoxalase-RGCTTTGCAGACAGTT-GAAACCGCTGTCCCCATGAATGT-TC176[20]ABC-2typetransporterABC-FABC-2AGCGGACAGGTACATTG-GAACCAATATGAGTTGC-CACGGG177[20]Sialidasegeneinf_Finf_RATACAGCAGAACCTTGGC-CTGCGATCACATG-GACGAGAAC234[18]TufgeneBinf-tFBinf-tRATCCGTCCGACCCAGACCCTCGACATCCTCACGGCC123[21]長雙歧桿菌豬亞種Serine/threonineproteinkinaseSerine-FSerine-RGCAACTCGAGGATTCCGACAACGGATTGGTGGTTT-GCTC166[20]1.3.5長雙歧桿菌菌株的亞種確認(rèn)利用亞種特異性弓物對(duì)40株亞種未知的長雙歧桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶情況區(qū)分長雙歧桿菌的不同亞種。并選擇擴(kuò)增結(jié)果為嬰兒亞種的菌株送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因組草圖掃描，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以驗(yàn)證其為長雙歧桿菌嬰兒亞種。2結(jié)果與分析2.113株已測基因組菌株的亞種確認(rèn)從NCBI數(shù)據(jù)庫（/）中獲取已確認(rèn)亞種的長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種、長雙歧桿菌豬亞種菌株的基因組序列（各10個(gè)）,與本團(tuán)隊(duì)前期已測全基因組但尚未確認(rèn)亞種的13株長雙歧桿菌進(jìn)行直系同源基因分析，共獲得核心基因941個(gè)，基于這些核心基因，構(gòu)建了43株菌系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。圖1基于43株長雙歧桿菌核心基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1Phylogenetictreeof43Bifidobacteriumlongumbasedoncoregenes注："■"為長雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”為長雙歧桿菌長亞種；“?”為長雙歧桿菌豬亞種；“★”為已測定全基因組但尚未確認(rèn)亞種的長雙歧桿菌。結(jié)果顯示，30株長雙歧桿菌不同亞種分別位于不同分支上，而本團(tuán)隊(duì)前期已測基因組的13株菌分別屬于3個(gè)不同亞種，其中7株是長雙歧桿菌長亞種、5株為長雙歧桿菌嬰兒亞種、1株為長雙歧桿菌豬亞種。2.2不同長雙歧桿菌碳水化合物利用能力比較根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［25-26］選擇了長雙歧桿菌不同亞種利用能力存在顯著差異的6種碳水化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸鈉、甘露糖和巖藻糖，以進(jìn)一步確認(rèn)長雙歧桿菌不同亞種碳水化合物利用譜差異。結(jié)果顯示，所測定的長雙歧桿菌長亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種、長雙歧桿菌豬亞種共14株菌利用不同碳水化合物產(chǎn)酸能力存在差異（表3）。3個(gè)亞種均可利用核糖和巖藻糖；長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌豬亞種不能利用葡萄糖醛酸鈉，而長雙歧桿菌嬰兒亞種FHeNJZ44M8、M2-03-F02-27和ATCC15697三株菌可利用葡萄糖醛酸鈉，其余3株卻不能利用；長雙歧桿菌長亞種中除FGZ16I1M5夕卜，均可利用阿拉伯糖和木糖產(chǎn)酸。同一亞種的菌株利用同一種碳水化合物的能力存在差異，故根據(jù)不同碳水化合物利用能力的差異難以實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌不同亞種的區(qū)分。表3長雙歧桿菌不同亞種的碳水化合物利用比較Table3CarbohydrateutilizationcapacityofdifferentBifidobacteriumlongumstrains亞種菌株阿拉伯糖木糖核糖葡萄糖醛酸鈉甘露糖巖藻糖長雙歧桿CCFM685+++--+菌長亞種CCFM686+++--+CCFM752+++-++CCFM756+++-++CCFM762+++-++FGZ6I1M6+++-++FGZ16I1M5--+-++長雙歧FHeNJZ44M8--++++桿菌嬰兒M2-03-F02-27--++++亞種ATCC15697--++-+FGZ17I1M1--+-++FGZ19I1M3--+-++FGZ23I1M2--+-++長雙歧桿菌豬亞種CCFM688+++-++注：“+”代表菌株利用該碳水化合物產(chǎn)酸；"-”代表菌株未利用該碳水化合物產(chǎn)酸。2.3不同亞種的特異性基因分析根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道選擇了9個(gè)亞種特異性基因（表2）,對(duì)14株亞種確認(rèn)的長雙歧桿菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以評(píng)價(jià)這個(gè)特異性基因的有效性。MarR基因是長雙歧桿菌長亞種的特異性基因，理論擴(kuò)增條帶為168bp，但7株長雙歧桿菌長亞種的擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅CCFM762（圖2-b）、CCFM756（圖2-g）可成功擴(kuò)增出168bp的條帶，其余長亞種菌株無擴(kuò)增產(chǎn)物；TerB基因的擴(kuò)增結(jié)果也類似，僅CCFM685（圖2-c）、CCFM686（圖2-d）和FGZ16I1M5（圖2-f）可擴(kuò)增出正確大小的條帶（156bp），其余長亞種菌株均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，這2個(gè)基因無法用于長雙歧桿菌長亞種的區(qū)分。盡管所有長亞種菌株可擴(kuò)增出Sugarkinase基因（圖2），嬰兒亞種菌株也不能擴(kuò)增出該基因（圖3），但豬亞種同樣擴(kuò)增出該基因（圖4），因此，該基因也無法區(qū)分長亞種和豬亞種，但可用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的確認(rèn)。所有長亞種菌株（圖2）和豬亞種菌株（圖4）可擴(kuò)增出長亞種Tuf基因，而嬰兒亞種菌株（圖3）也可擴(kuò)增出條帶，該基因無法快速區(qū)分不同亞種。a~g-FGZ6I1M6、CCFM762、CCFM685、CCFM686、CCFM752、FGZ16I1M5、CCFM756圖2長雙歧桿菌長亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.2PCRelectrophoresisresultsofB.longumsubsp.longum注：M-DNAMarker;1~9表示分別用MarR、TerB、lon、Blo、Glyoxalase、ABC、inf、Binf、Serine弓物擴(kuò)增。下同。a~f-M2-03-F02-27、FHeNJZ44M8、ATCC15697、GZ17I1M1、GZ19I1M3、GZ23I1M2圖3長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.3PCRelectrophoresisresultsofB.longumsubsp.infantis圖4長雙歧桿菌豬亞種菌株P(guān)CR電泳結(jié)果Fig.4PCRelectrophoresisresultsofB.longumsubsp.suisGlyoxalase基因是長雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，理論擴(kuò)增條帶為168bp，但6株長雙歧桿菌嬰兒亞種的擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有ATCC15697（圖3-c）可擴(kuò)增出168bp的條帶，其余嬰兒亞種菌株沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；ABC基因的結(jié)果也類似，M2-03-F02-27（圖3-a）沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，這2個(gè)基因無法用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。Sialidase基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株可成功擴(kuò)增得到正確大小的條帶（圖3），而長雙歧桿菌長亞種（圖2）和長雙歧桿菌豬亞種（圖4）均無擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，Sialidase基因可用于長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。嬰兒亞種Tuf基因是長雙歧桿菌嬰兒亞種的特異性基因，該基因理論擴(kuò)增條帶為123bp，但所用14株菌的擴(kuò)增結(jié)果顯示，長雙歧桿菌長亞種FGZ6I1M6（圖2-a）、CCFM685（圖2-c）、CCFM756（圖2-g）和長雙歧桿菌嬰兒亞種菌株（圖3）均可以擴(kuò)增出100bp左右的條帶，因此，該基因的區(qū)分效果同樣不佳。而豬亞種的特異性基因Serine，理論擴(kuò)增條帶為166bp，但擴(kuò)增結(jié)果顯示，CCFM688（圖4）沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒于菌株數(shù)量太少，還需進(jìn)一步確認(rèn)。為了解析不同基因擴(kuò)增效果的差異，進(jìn)一步利用Primer-BLAST（/tools/primer-blast/）來分析弓物的特異性（表4）。結(jié)果顯示，MarR和TerB的引物只能擴(kuò)增出長雙歧桿菌長亞種菌株，但擴(kuò)增出的菌株數(shù)較少，說明基因的特異性過強(qiáng)，可能不能廣泛區(qū)分長亞種；Sugarkinase和長亞種Tuf基因的弓物可擴(kuò)增出長雙歧桿菌長亞種和豬亞種，也就解釋了這兩個(gè)基因均無法實(shí)現(xiàn)長亞種和豬亞種的區(qū)分的原因，且長亞種Tuf基因可擴(kuò)增出多個(gè)不同大小的片段；基因Glyoxalase和基因ABCPrimer-BLAST只能擴(kuò)增出部分長雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較強(qiáng)，不能廣泛用于區(qū)分嬰兒亞種；Sialidase基因可擴(kuò)增出全部長雙歧桿菌嬰兒亞種，基因的特異性較好；嬰兒亞種Tuf基因可擴(kuò)增出全部長雙歧桿菌嬰兒亞種，但可擴(kuò)增出多個(gè)不同大小的片段；基因SerinePrimer-BLAST只能擴(kuò)增出部分長雙歧桿菌豬亞種，無法實(shí)現(xiàn)豬亞種的區(qū)分。表4特異性基因Primer-BLAST結(jié)果Table4ThePrimer-BLASTresultsofspecificgenes亞種基因名稱Primer-BLAST結(jié)果長雙歧桿菌長亞種長雙歧桿菌嬰兒亞種長雙歧桿菌豬亞種長雙歧桿菌長亞種MarR44--TerB44--Sugarkinase100-100Tuf100-100長雙歧桿菌嬰兒亞種Glyoxalase-50-ABC-50-Sialidase-100-Tuf-100-長雙歧桿菌豬亞種Serine--33注：表中數(shù)字為弓物擴(kuò)增出的菌株數(shù)占該亞種菌株總數(shù)的比例；"-”表示弓物未擴(kuò)增出該亞種菌株。綜上可知，長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可有效實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種與其他兩亞種的區(qū)分，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后條帶的有無及大小初步實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的區(qū)分。若嬰兒亞種唾液酸酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后產(chǎn)生234bp左右的條帶且長亞種糖激酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后無條帶產(chǎn)生，則該菌株可初步確認(rèn)為長雙歧桿菌嬰兒亞種。2.4長雙歧桿菌嬰兒亞種的確認(rèn)采用上述區(qū)分效果較好的長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)40株亞種未知的長雙歧桿菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳后的條帶結(jié)果顯示，HeNJZ8M1、FJND16M4、JSSZ7M7、FHuNCS6M8和JSYC2M1共5株菌為長雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長雙歧桿菌長亞種或豬亞種（圖5）。圖540株長雙歧桿菌PCR電泳結(jié)果Fig.5PCRelectrophoresisresultsof40Bifidobacteriumlongum為進(jìn)一步驗(yàn)證目前所確認(rèn)亞種的準(zhǔn)確性，從5株新確認(rèn)的長雙歧桿菌嬰兒亞種中隨機(jī)選擇了4株，即HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4、JSSZ7M7寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因組草圖測序。并將上述4株菌與圖1中43株菌合并進(jìn)行同源基因分析，共獲得938個(gè)核心基因?；谶@些核心基因，構(gòu)建了該47株菌系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。結(jié)果顯示，經(jīng)特異性基因擴(kuò)增確認(rèn)為長雙歧桿菌嬰兒亞種的4株菌(HeNJZ8M1、FHuNCS6M8、FJND16M4和JSSZ7M7)確為長雙歧桿菌嬰兒亞種，進(jìn)一步證實(shí)了基于長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因的特異性擴(kuò)增可有效實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分。圖6基于47株長雙歧桿菌核心基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6Phylogenetictreeof47Bifidobacteriumlongumbasedoncoregenes注："■"長雙歧桿菌嬰兒亞種；“▲”長雙歧桿菌長亞種；“?”長雙歧桿菌豬亞種；“★”新確認(rèn)的長雙歧桿菌嬰兒亞種。3結(jié)論本研究對(duì)13株已測定基因組的長雙歧桿菌經(jīng)生物信息學(xué)分析確認(rèn)了亞種，其中7株為長雙歧桿菌長亞種，5株為長雙歧桿菌嬰兒亞種，1株為長雙歧桿菌豬亞種。對(duì)亞種確認(rèn)的長雙歧桿菌進(jìn)行了碳水化合物利用譜比較，但碳水化合物利用譜難以實(shí)現(xiàn)不同亞種的區(qū)分。后采用特異性基因擴(kuò)增的方法確認(rèn)了長雙歧桿菌長亞種糖激酶基因和長雙歧桿菌嬰兒亞種唾液酸酶基因可實(shí)現(xiàn)長雙歧桿菌嬰兒亞種的快速區(qū)分，并采用這對(duì)特異性基因從40株長雙歧桿菌中成功確認(rèn)了5株長雙歧桿菌嬰兒亞種，其余35株菌均為長雙歧桿菌長亞種或豬亞種，隨機(jī)選擇4株進(jìn)行全基因組草圖測序，進(jìn)一步分析證實(shí)確為長雙歧桿菌嬰兒亞種。遺憾的是，因長雙歧桿菌豬亞種可用菌株數(shù)量極少，長雙歧桿菌長亞種和長雙歧桿菌豬亞種的快速區(qū)分仍有待進(jìn)一步參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】CHAPLINAV,EFIMOVBA,SMEIANOVVV,etal.Intraspeciesgenomicdiversityandlong-termpersistenceofbifidobacteriumiongum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