綿羊痘和山羊痘診斷技術 編制說明

1《綿羊痘和山羊痘診斷技術》編制說明綿羊痘和山羊痘（以下簡稱為羊痘）分別由綿羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPV）和山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GPV）引起。綿羊痘病毒（Sheeppox（Poxviridae）、脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirdae）、山羊痘病毒屬病毒（Capripoxvirus,CaPV）。我國《一、二、三類動物疫病病種名錄》將其列為膜、器官表面廣泛性丘疹或結(jié)節(jié)，皮膚水腫，淋巴結(jié)腫大，消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴重時導致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的危害，造成嚴重的經(jīng)濟損失，在英國發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可達100%。世界各國均有羊痘發(fā)病和流行的相關報道，目前非洲北部、中東和亞洲的部分國家流行較為嚴重。羊痘是阻礙引進綿羊和山羊珍貴品種以及養(yǎng)羊業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的主要障礙。嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)。該病對養(yǎng)殖業(yè)破壞巨大，可以通過節(jié)肢動物機械性接觸傳播。蚊子、蒼蠅和蜱等均可能是疫情跨地域遠距離擴國現(xiàn)有疫情提供技術參考。國內(nèi)現(xiàn)行的只有行標NY/T576-2015綿羊痘和山羊長，敏感性不高，結(jié)果判定人為主觀性因素太大。并且該標準缺少病毒實時熒2光PCR檢測方法、病毒LAMP檢測方分子生物學檢測方法相較于病毒分離、中和試驗等其它檢測方法具有檢測速度快，檢測結(jié)果量化、準確的優(yōu)點，該方法在在臨床檢測和大面積監(jiān)測等方面具有重要價值，對當前疫情的處理及防控意義重大。血清學酶聯(lián)免疫抗體檢測方法具有試驗材料易獲取，對試驗環(huán)境、設備及人員的要求較低、檢測速度快，敏感性高于中和試驗，結(jié)果判定更為簡單的優(yōu)點，在臨床檢測和疫苗免疫大面積抗體監(jiān)測等方面具有重要價值，對疫情的處理及防控意義重大。目前沒有該病診斷技術方面的國家標準，尤其在進出境動物及產(chǎn)品檢驗檢疫中，迫切本標準規(guī)定了羊痘診斷技術的范圍、規(guī)范性引用文件、術語和定義、縮略語、原理、試劑與耗材、儀器與設備、操作步驟、結(jié)果分析與表述。本標準適本標準實用、準確、敏感，具有十分重要的實際應用價值。將其在基層推2023年1月，全國動物衛(wèi)生標準化委員會以國家標準計劃項目形式，下達了制定《綿羊痘和山羊痘診斷技術》國家標準的任務，任務編號：本標準由農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管局組織，歸口單位為全國動物衛(wèi)生標準化技術委員會，起草單位為中國動物疫病預防控制中心、青海省動物疫病預防控制中心、新疆生產(chǎn)建設兵團動物疫病預防控制中心、甘肅省動物疫病預防控制中心、黑龍江省動物疫病預防與控制中心、北京億森寶生物科技有限公司，重慶市動物疫病預防控制中心、山東省動物疫病預防與控制中心、北京市動物疫病預防控制中心、陜西省動物疫病預防控制中心、廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心、成都海關技術中心、山西省動物疫病預防控制中心、河北3金山、闞威、鄭思思、趙儉波、鐘映梅、張旭、曹麗萍、孫航、劉穎昳、李曉霞、徐琦、畢一鳴、王新杰、孫曉明、高姍姍、白雪冬、陳昭旭、曾政、駱璐、蘭鄒然、張月、趙浩軍、李棟梁、趙光明、施開創(chuàng)、莫勝蘭、林華、雷宇孫雨：中國動物疫病預防控制中心，主持標準修訂、編制及實驗室研究的楊林：中國動物疫病預防控制中心，負責標準文本的科學性與規(guī)范性審蔡金山：青海省動物疫病預防控制中心，負責臨床陽性樣品的收集與鑒鄭思思：青海省動物疫病預防控制中心，負責臨床陽性樣品的收集與鑒4孫航：中國動物疫病預防控制中心，負責ELISA方法、PCR方法以及張月：山東省動物疫病預防與控制中心，負責臨床陽性樣品的收集與鑒李棟梁：北京市動物疫病預防控制中心，負責臨床陽性樣品的收集與鑒莫勝蘭：廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，負責血清學試驗的開5要按標準各階段為單位分別編寫。列出各階段的關鍵內(nèi)容。征求意見、審查階段的主要內(nèi)容要詳細給出。征求意見要對征求對象的代表性、回復情況、討論標準制定思路，制定標準制定方案，明確項目任務分工，全面計劃標準制一是查閱文獻資料：查閱了目前國內(nèi)關于羊痘的相關法律規(guī)范要求、研究文獻，部分發(fā)達國家做法、WOAH《陸生動物衛(wèi)生法典》和《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》的要求等。參考我國NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術技術規(guī)范。結(jié)合我國動物疫病預防控制機構(gòu)獸醫(yī)實驗室以及檢驗檢疫部門檢測實驗室的實驗室檢測工作實際，確定了本技術標準的框架。標準起草工作組認6三是進行技術驗證：標準起草工作組經(jīng)過技術咨詢、調(diào)研，收集、整理和分析有關資料，并結(jié)合羊痘診斷方法、技術路線、應用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢等。并些試驗方法的準確性與可靠性,并在此基礎上，形成“標準征求意見稿”，然后行病學中心、中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所、江西省動物疫病預防與控制中心、新疆生產(chǎn)建設兵團動物疫病預防與控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預防控制中心、甘肅省動物疫病預防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所、西南大學、西藏自治區(qū)動物疫病預防控制中心、北京熱景生物技術股份二、標準編制原則和確定標準主要內(nèi)容的依據(jù)大量收集國內(nèi)外資料的基礎上，篩選建立檢測技術，并通過對大量臨床樣品的檢測，對標準所列方法進行驗證，對數(shù)據(jù)進行科學的統(tǒng)計分析，同時征求國內(nèi)調(diào)所有檢測方法一定是最先進的技術和最先進的方法，以符合行業(yè)實情和要求為目標，并通過在動物疫控系統(tǒng)獸醫(yī)實驗室的應用，驗證標準的可操作性；三7診斷試驗和疫苗手冊》和我國NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術規(guī)范的相關技術內(nèi)容，在國際推薦技術在我國適用的前提下，優(yōu)先選擇國際推薦技術主要內(nèi)容包括技術指標、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則由于目前國內(nèi)現(xiàn)行的只有行標NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術，但是NY/T576-2015標準中只包含綿羊痘與山羊痘的病毒分離、電鏡檢查、包涵體判定人為主觀性因素太大。并且該標準缺少分子生物學病毒PCR檢測方法、病毒實時熒光PCR檢測方法、病毒LAMP檢測方法和血清學酶聯(lián)免疫抗體檢測方法的內(nèi)容。中國動物疫病預防控制中心參考WOAH發(fā)布的《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》和NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術，結(jié)合近年來從事羊痘監(jiān)測工作本標準的臨床診斷和病毒分離鑒定兩部分技術內(nèi)容主要依據(jù)《默克獸醫(yī)手冊》和WOAH《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）3.8.12章綿羊痘和山羊痘章節(jié)中，病原鑒定從活體或剖檢組織中分離病毒等內(nèi)容，同時參考我國近些年發(fā)表的羊課題組從WOAH英國綿羊痘和山羊痘參考實驗室購買了羊痘病毒的對照血清、細胞及疫苗毒株，用于病毒中和試驗。同時利用大量的田間樣品進行了所建立標準所列的分子生物學檢測方法過程中，課題組分析比F103基因的遺傳精確性較高，可以被用做病毒核酸檢測的目標基因。最終本標8測方法和實時熒光PCR檢測方法檢測方法。選用O三、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術經(jīng)濟論證，預期本單位組織實施了相關重要的試驗項目進行驗證，實施的試驗項目主要（一）主要試驗或驗證的分析目前，羊痘病毒的檢測方法包括病原學檢測和血清學檢測。病原學檢測方果直觀等優(yōu)點，尤其適合樣品病毒含量低情況下的快速檢測。血清學檢測方法主要是中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法，用于檢測抗體，從而了解病毒等的優(yōu)化，增強了該方法特異性、敏感性和檢出率。根據(jù)這一思路，應用生物毒屬的P32基因作為靶序列，設計常規(guī)PCR檢測方法引物、熒光染料引物與LAMP引物，擴增目的基因序列，通過多種試驗方案，優(yōu)化了山羊痘病毒屬中不同病料中病毒DNA的提取方法、引物濃度和反應最適溫度。根據(jù)優(yōu)化的條件，檢測不同山羊痘病毒屬的樣品，提高了檢測的特異性和敏感性。特異性方種方法與其它臨床癥狀類似的口蹄疫等病原均無交叉，均未檢測到目的條帶或9種方法均具有良好的重復性。實時熒光PC方法特異性強、敏感性高、試驗結(jié)果準確可靠。為了進行免疫效果評估與感染狀況的監(jiān)測，根據(jù)山羊痘病毒屬的P32基因，表達了山羊痘病毒屬病毒重組蛋以不同的引物濃度濃度進行預實驗，篩選到最佳引物濃度。同時以不同退（PPRV）、山羊關節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進行擴增以驗證本方法的特異性。特異性試驗結(jié)果表明(圖2)，對照組用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒株以不同的引物濃度進行預實驗，篩選到最佳引物濃度。同時以不同退火溫度進行PCR檢測方法反應最終確立最適反應條件。篩選最優(yōu)反應體系詳見下用分光光度計測定重組質(zhì)粒的OD260值，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)。然后作制備標準品，以各個濃度的質(zhì)粒作為模板進行擴增，試驗結(jié)果顯示，濃度在（PPRV）、山羊關節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進行擴增以驗證本方法的特異性。特異性試驗結(jié)果表明(圖7)，對照組為0.77%、1.23%和1.31%，批間重復變異系數(shù)分別為1.25%、0.91%和變TheCTvaluesof3異TheCTvaluesof3標系標準差%行試驗，CaPV熒光定量PCR檢測方法對質(zhì)粒標準品的的檢測下限為101用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒以不同的引物濃度進行預實驗，篩選到最佳引物濃度。同時以不同反應溫（PPRV）、山羊關節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進行擴增以驗證本方法的特異性。特異性試驗結(jié)果表明(圖10)，對照組編編用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒株抗體ELISA檢測方法檢測上述30份陰性血清，并重復清號價1 編編清號價2 3—4 5—6 7—8 9— — — — — — — —編編清號價 — — — NC//////////采用特異性質(zhì)控血清5份，均為羊痘病毒抗體陰性血清，分別是羊口蹄疫A型病毒陽性血清、牛病毒性腹瀉病毒陽性血清、山羊關節(jié)炎/腦炎病毒陽性血由中國動物疫病預防控制中心制備、提供。將這5份血清用酶聯(lián)免疫分析檢測方法重復三次檢測，同時采用中和試驗進行平行實驗，比較2種檢測方法的特驗值值9—8 6—8——0清NC//////////2.2.敏感性指標驗證2.2.1最小檢出量試驗1:512、1:1024、1:2048進行稀釋，采用酶聯(lián)免疫分析檢測法對上述稀釋后的血清進行檢測，同時用中和試驗進行檢測。結(jié)果顯示，三次重復試驗數(shù)據(jù)一致，測山羊痘病毒屬病毒抗體的靈敏度要高于中和試驗，更適用于抗體含量較低的///NC///30號為綿羊陽性血清。由中國動物疫病預防控制中心制備、保存。采用酶聯(lián)免率。結(jié)果顯示：三次酶聯(lián)免疫分析檢測法和份山羊陽性血清、15份綿羊陽性血清），酶聯(lián)免疫分析檢測法和中和試驗的檢1+2+3+4+5+6+7+8+94++++++++++++++++++++++/////NC/////2、中和試驗判定標準：中和效價≥1：5判為陽性，中和效價＜1：5判為陰性。目前，羊痘病毒的檢測方法包括病原學檢測和血清學檢測。病原學檢測方果直觀等優(yōu)點，尤其適合樣品病毒含量低情況下的快速檢測。血清學檢測方法主要是中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法，用于檢測抗體，從而了解病毒測方法、血清中和試驗、間接免疫熒光抗體等進行羊痘病毒診斷。我國在2015年頒布了行業(yè)標準《綿羊痘和山羊痘診斷技術》（NY/T576—2015），推薦使用的診斷方法包括電鏡觀察、病毒分離、血清中和試驗診斷方法。這些方法對羊痘診斷起到了重要的作用，隨著近年來分子生物學和免疫學技術的發(fā)展，病標準結(jié)合我國羊痘診斷技術究的新進展、新成果薦標準等，將相關診斷技術進一步標準化，使該標準進一步完整、系統(tǒng)、實羊痘在我國已經(jīng)有發(fā)病的報道，并且有文獻介紹了相關病原檢測方法。分子生物學檢測方法可以使檢測速度更快，檢測結(jié)果量化從而更加準確，可快速確定病原。血清學抗體檢測方法可以快速檢測疫苗免疫后動物體內(nèi)的抗體水四、采用國際標準和國外先進標準的程度，以及與國際、國內(nèi)同類標準水平的對比情況，或與測試的國外樣品隨著羊痘在世界范圍的不斷蔓延，建立檢測標準尤為重要。目前，國際上針對綿羊痘和山羊痘（羊痘）僅有WOAH陸生動物手冊2.7.14，W