第七章-微生物的遺傳變異和育種

第七章微生物的遺傳

變異與育種微生物是遺傳學研究中的明星：1.

物種和代謝類型多樣性（600萬種以上）2.微生物細胞結構簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。3.易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。4.對環(huán)境因素敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。模式生物遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一遺傳與變異的概念遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因組所攜帶的遺傳信息。

——是一種內(nèi)在可能性或潛力。

遺傳型+環(huán)境條件表型表型（phenotype）：指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境條件下通過代謝和發(fā)育而得到的具體體現(xiàn)。

——是一種現(xiàn)實存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。代謝發(fā)育變異(variation):生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結構或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。變異的特點：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.性狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：一種不涉及遺傳物質(zhì)結構改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點是：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度??；c.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復。例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復產(chǎn)色素的能力。遺傳與變異的概念第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間德國Weismann提出。認為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結構的化合物?；?qū)W說：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實驗對象進行的三個著名實驗的論證（肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗、噬菌體感染試驗、病毒的拆開與重建試驗），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎的三個經(jīng)典實驗F.Griffith，

研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌）S型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性;R型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation）1928年，Griffith進行了以下幾組實驗：（1）動物實驗

對小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

對小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活R菌和熱死S菌———小鼠死亡

抽取心血分離

活的S菌加熱殺死的S型細菌里可能存在一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它能通過某種方式進入R型細胞，使其獲得S型的遺傳特性（2）細菌培養(yǎng)實驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗以上實驗說明：加熱殺死的S型細菌細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入R型細胞并使R型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾型細胞。熱死S菌—————不生長

活R菌—————長出R菌

熱死S菌—————長出大量R菌和10-6SI菌活R菌+S菌無細胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌+活R菌平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)

1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進行了轉(zhuǎn)化試驗：只有S型細菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的是以DNA為遺傳物質(zhì)基礎的遺傳信息。對各種生化組分進行轉(zhuǎn)化試驗（二）噬菌體感染實驗（三）植物病毒的重建實驗為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進行了著名的植物病毒重建實驗。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。

選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：（1）RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。上述結果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎也是核酸,只不過是RNA。（一）7個水平1、細胞水平：大部分DNA都集中在核區(qū)或細胞核中，核的數(shù)目因微生物種類不同而不同。2、細胞核水平：真核微生物的DNA與組蛋白在一起形成核染色體；原核生物的只有核區(qū)。統(tǒng)稱為核基因組、核染色體組或基因組。二、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的部位和方式3、染色體水平：不同微生物染色體數(shù)目不一樣，多數(shù)微生物是單倍體，少數(shù)情況下是雙倍體，如合子。4、核酸水平除病毒的遺傳物質(zhì)有RNA外，其余生物的遺傳物質(zhì)是DNA除病毒的遺傳物質(zhì)有單鏈的RNA或DNA外，其余生物的遺傳物質(zhì)是雙鏈DNA不同微生物基因組差別極大5、基因水平基因是生物體內(nèi)一切具有自主復制能力的最小遺傳功能單位，其物質(zhì)基礎是一條以直線排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。6、密碼子水平遺傳密碼是指DNA鏈上決定各具體氨基酸的特定核苷酸排列順序每一密碼子由3個核苷酸序列即1個三聯(lián)體組成。7、核苷酸水平是一個最低突變單位。絕大多數(shù)生物的DNA由腺苷酸、胸苷酸、鳥苷酸和胞苷酸組成。三、原核生物的質(zhì)粒

1.定義：

質(zhì)粒（plasmid）：凡游離于原核生物核基因組外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA分子，即cccDNA，就是典型的質(zhì)粒。2、結構特點通常以共價閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；3.質(zhì)粒的性質(zhì)①可以在細胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；附加體(episome)：某些質(zhì)粒具有與核染色體整合、脫離的功能，這類質(zhì)粒稱附加體。②質(zhì)粒是一種復制子（replicon），根據(jù)自我復制能力的不同，可把質(zhì)粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒的類型嚴緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)：與核染色體的同步復制，這類細胞中僅含1—2個質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)：與核染色體的不同步復制，這類細胞中含10—15甚至更多個質(zhì)粒。4、質(zhì)粒在基因工程中的應用質(zhì)粒的優(yōu)點：（1）體積小，易分離和操作（2）環(huán)狀，穩(wěn)定（3）獨立復制（4）拷貝數(shù)多（5）存在標記位點，易篩選E.coli的pBR322質(zhì)粒是一個常用的克隆載體5、質(zhì)粒的分離與檢定提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；幾種代表性質(zhì)粒1.F質(zhì)粒（fertilityfactor）：又稱F因子、致育因子或性因子。是E.coli等細菌決定性別并有轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當于雌性）。2.R質(zhì)粒（resistencefactor）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。抗性質(zhì)粒在細菌間的傳遞是細菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。R質(zhì)?？剐赞D(zhuǎn)移因子（RTF）：轉(zhuǎn)移和復制基因抗性決定因子：抗性基因大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細菌素為colicins（大腸桿菌素），大腸桿菌素是由Col質(zhì)粒編碼。3.Col質(zhì)粒（colicinogenicfactor）Col質(zhì)粒:能編碼大腸菌素基因，大腸菌素是一種細菌蛋白，只殺死近緣且不含Col質(zhì)粒的菌株，而宿主不受其產(chǎn)生的細菌素影響。許多細菌都能產(chǎn)生抑制或殺死其他近緣細菌或者同種不同菌株的代謝產(chǎn)物，所以稱為細菌素。即誘癌質(zhì)粒。

引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子，其宿主是一種根癌土壤桿菌，是當前植物基因工程中使用最廣、效果最佳的克隆載體。

4.Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）

存在于發(fā)根土壤桿菌中，引起許多雙子葉植物患毛根瘤。可作為外源基因的良好載體和合成次生代謝產(chǎn)物。5.Ri質(zhì)粒是近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。6.mega質(zhì)粒（巨大質(zhì)粒）降解性質(zhì)粒：這類質(zhì)?？蔀榻到庖幌盗袕碗s有機物的酶編碼，可在污水處理、環(huán)境保護等方面發(fā)揮特有的作用。含有數(shù)種降解性質(zhì)粒的菌株“超級菌”7.降解性質(zhì)粒第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變

是變異的一類，泛指細胞內(nèi)（或病毒粒類）遺傳物質(zhì)的分子結構或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產(chǎn)生。野生型（wildtype）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株突變體（mutant）：野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株（一）基因突變的類型按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selectivemutant）：具有選擇標記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selectivemutant）：無選擇標記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性。條件致死突變型——某菌株在基因突變后，在某種條件下可正常生長、繁殖，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖。Ts突變株即溫度敏感株：是一類典型的條件致死突變型。例如大腸桿菌的某些菌株在37℃以下正常生長，卻不能42℃以下正常生長形態(tài)突變型—基因突變后引起的個體或菌落形態(tài)發(fā)生變異?？乖蛔冃汀蛲蛔兒笠鸺毎乖Y構發(fā)生變異。產(chǎn)量突變型——基因突變后引起代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。

選擇性突變株非選擇性突變定義：某一細胞（或病毒粒）在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率：可采用營養(yǎng)缺陷型的回復突變株或抗藥性突變株來檢測。例如：突變率為10-8：一億次分裂中，會發(fā)生一次突變。（二）突變率若干細菌某一性狀的自發(fā)突變率菌名 突變性狀 突變率E.coli 抗T1噬菌體 3×10–8E.coli 抗T3噬菌體 1×10–7

E.coli 不發(fā)酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外線 1×10–5Staphylococcusaureus 抗青霉素 1×10–7

（1）自發(fā)性：指可自發(fā)地產(chǎn)生突變（2）不對應性：突變性狀與引起突變的原因之間無直接對應關系（3）稀有性：自發(fā)突變的幾率很低，在10-6~10-9間（4）獨立性：某基因的突變率不受它種基因突變率的影響（5）可誘變性：通過物理或化學因子的處理，可大大提高突變率（6）穩(wěn)定性：突變后的新性狀是可遺傳的，穩(wěn)定的（7）可逆性：野生型菌株發(fā)生突變后，也能發(fā)生回復突變。（三）突變的特點（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明

在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當長時間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過幾個嚴密而巧妙的實驗設計，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場紛爭。證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應關系！如何證明基因突變的自發(fā)性和不對應性?三個經(jīng)典實驗變量實驗、涂布實驗、影印實驗實驗證據(jù)變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaS.E.盧瑞亞

MaxDelbruckM.戴爾布魯克

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969變量實驗（fluctuationanalysis）Newcombe的涂布實驗(1949)

影印實驗(replicaplating)JoshuaLederbergandEstherLederberg(1952)JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點突變（一對堿基）和畸變（一段染色體）。具體類型可歸納如下：（五）基因突變及其機制1.誘發(fā)突變誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質(zhì)結構變化的特點討論幾種有代表性的誘變劑的作用機制。（1）堿基的置換堿基置換是染色體的微小損傷，只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分轉(zhuǎn)換和顛換。誘變的機制：直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應，引起DNA復制時發(fā)生轉(zhuǎn)換；有的是堿基類似物，通過活細胞的代謝活動摻入到DNA分子中引起轉(zhuǎn)換。常見誘變劑：亞硝酸、各種烷化劑（直接作用）；5-溴尿嘧啶（2）移碼突變指誘變劑會使DNA序列中的一個或少數(shù)幾個核苷酸發(fā)生增添或缺失，從而使該處后面的全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，并進一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。能引起移碼突變都是一些吖啶類化合物突變機制：吖啶類化合物的結構與嘌呤-嘧啶對十分相似，能嵌入兩個相鄰的DNA堿基對之間。（3）染色體畸變主要是指DNA分子的大損傷，包括缺失、重復、插入、易位和倒位，也包括染色體數(shù)目的變化。轉(zhuǎn)座：DNA序列通過非同源重組的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座因子：又稱可移動基因，或跳躍基因，指具有轉(zhuǎn)座作用的一段DNA序列。定義：指生物體在無人工干預下自然發(fā)生的低頻率突變。自發(fā)突變的原因：（1）背景輻射和環(huán)境因素；（2）自身有害代謝產(chǎn)物；（3）DNA復制過程中堿基配對錯誤引起。2、自發(fā)突變紫外線對DNA的損傷機制是使相鄰嘧啶形成嘧啶二聚體和水合物，相鄰嘧啶形成二聚體后，造成局部DNA分子無法配對，從而引起微生物的死亡或突變。設備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等。樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm。照射時，要用磁力攪拌器攪拌。（六）紫外線（UV）對DNA的損傷及其修復把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，即光復活作用。機制：經(jīng)UV照射后帶有嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會與一種光激活酶——光解酶結合，這種復合物在可見光下，光解酶會獲得光能而激活，并使二聚體重新分解成單體。指導意義：在利用UV進行誘變育種時，要在紅光下進行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。1、光復活作用又稱暗修復，是一種用于對被UV等誘變劑損傷后的修復方式，其特點是不依賴可見光，只通過酶切作用去除嘧啶二聚體隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復方式。核酸內(nèi)切酶：作用位點在多核苷酸鏈的內(nèi)部，打開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口。核酸外切酶：作用位點從多核苷酸鏈的5’-P至3’-OH方向切除二聚體。共需要四種酶：核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶2、切除修復微生物育種所經(jīng)歷的大致歷程：從生產(chǎn)中選育或定向培育選育（未采用誘變劑，自發(fā)突變株）——采用誘變劑進行誘變，提高突變頻率，篩選有用菌株——利用接合、原生質(zhì)體融合等技術使基因發(fā)生重組（細胞水平）——體外DNA重組技術（基因工程技術）創(chuàng)造具有新的生物性狀的生物二、突變與育種微生物育種的目的是人為地使某種代謝產(chǎn)物過量積累，最大程度降低成本，把生物合成的途徑朝人們所希望的方向引導，最終獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和低耗的菌種。（一）自發(fā)突變及育種

主要是通過實踐經(jīng)驗選擇生產(chǎn)中發(fā)生自發(fā)突變的菌株或不斷轉(zhuǎn)接微生物菌株以期獲得其自發(fā)突變菌株。特點：費時、費力，工作被動，守株待兔式的例：卡介苗的篩選，連續(xù)接種230代定義：指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學實驗或生產(chǎn)實踐使用。（二）誘變育種1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)2、誘變育種的原則誘變劑物理因素化學因素紫外線激光離子束X射線r射線快中子烷化劑堿基類似物吖啶化合物（1）使用簡便有效的誘變劑Ames試驗：利用細菌模型了解潛在化學致癌物的誘變作用“生物化學統(tǒng)一性”法則：人和細菌在DNA的結構及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。誘變劑的共性原則：化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用

有些化學物質(zhì)會引起核酸結構的損傷并對生物具有致突變、致畸變和致癌變，常簡稱三致作用。美國加利福尼亞大學的BruceAmes教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復突變率。回復突變：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復，這種第二次突變稱為回復突變艾姆氏試驗：是一種利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效方法。菌種：鼠傷寒沙門氏菌his-；原理：his-在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復突變則長。證明Ames試驗重要性的應用實例：國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應的藥物“反應?！?，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應?！?，后來采用Ames試驗發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，出發(fā)菌株：就是用于育種的原始菌株。目前這項工作還僅憑經(jīng)驗（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單細胞或單孢子懸液：如霉菌或放線菌的分生孢子或細菌的芽孢（4）選用合適的誘變劑量紫外線劑量：強度與作用時間之乘積化學誘變劑劑量：濃度與處理時間來表示（5）充分利用復合處理的協(xié)同效應（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關指標（7）設計高效篩選方案（8）創(chuàng)造新型篩選方法3、三類突變株的篩選（1）產(chǎn)量突變株的篩選（2）抗藥性突變株的篩選（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（1）產(chǎn)量突變株的篩選（2）抗藥性突變株的篩選異煙肼是一種抗代謝藥物，能阻止敏感菌的生長，而吡哆醇是異煙肼的結構類似物，當敏感菌能在含異煙肼的培養(yǎng)基上生長時，能合成更高濃度的吡哆醇，克服了異煙肼的競爭性抑制，所以用梯度平板法可以篩選到高產(chǎn)吡哆醇的突變株。涂上誘變后的酵母菌基本培養(yǎng)基：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基。MM完全培養(yǎng)基：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。CM補充培養(yǎng)基：凡只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基。SM野生型：指從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生人為營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。遺傳型表示法是[A+B+]營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長。A營養(yǎng)缺陷型用[A-B+]表示，B營養(yǎng)缺陷型用[A+B-]表示原養(yǎng)型：一般指營養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回復突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。遺傳型均用[A+B+]表示（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法（見書P222）誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型鑒定營養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)（抗生素法）青霉素——細菌制霉菌素——真菌（菌絲過濾法）——絲狀真菌和放線菌夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法生長譜法a夾層培養(yǎng)法（3）營養(yǎng)缺陷型的篩選方法基本培養(yǎng)基——野生型完全培養(yǎng)基——營養(yǎng)缺陷型上、下兩層基本培養(yǎng)基的作用是使菌落夾在中間，以免細菌移動或被完全培養(yǎng)基沖散。B限量補充培養(yǎng)法c逐個檢出法d影印平板法滿足營養(yǎng)缺陷型滿足野生型基因重組：兩個獨立基因組內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，稱為基因重組。一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收了供體菌的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化作用。通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子。第三節(jié)基因重組和雜交育種兩個菌株或菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，取決于以下兩個因子：1、建立了感受態(tài)的受體細胞感受態(tài)：受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。2、外源游離DNA分子（轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)染：用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染的區(qū)別

轉(zhuǎn)化：在自然情況下，某些細菌溶解以后釋放的DNA被其他細菌吸收而發(fā)生轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在我們說到轉(zhuǎn)化，一般都是指實驗室內(nèi)從細菌里面純化的DNA分子直接導入遺傳性狀相異的細菌，比如質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，我們用的是純化的質(zhì)粒DNA本身，沒有任何媒介幫助。從這個概念的內(nèi)涵來說，只要DNA進入細菌，就完成了轉(zhuǎn)化過程。轉(zhuǎn)染：對于真核生物，轉(zhuǎn)染就是原核生物中轉(zhuǎn)化的同義詞；原核生物中，偶爾也用到轉(zhuǎn)染這個詞，當細菌的轉(zhuǎn)化過程中吸收的外源DNA是病毒DNA時就應該稱此過程為轉(zhuǎn)染（二）轉(zhuǎn)導（transduction）通過缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。細菌轉(zhuǎn)導的類型：普遍轉(zhuǎn)導局限轉(zhuǎn)導完全普遍轉(zhuǎn)導流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導低頻轉(zhuǎn)導高頻轉(zhuǎn)導1、普遍轉(zhuǎn)導通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象。（1）完全普遍轉(zhuǎn)導（定義見書P226）（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導（定義見書P227）2、局限轉(zhuǎn)導指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導子的現(xiàn)象。特點：（1）只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因；（2）該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；（3）缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主核染色體過程中發(fā)生低頻率的誤切或由于雙重溶源菌的裂解而形成（4）局限噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對溶源菌的誘導引起裂

解后才產(chǎn)生。（1）低頻轉(zhuǎn)導指通過一般溶源菌釋放的噬菌體所進行的轉(zhuǎn)導，因其只能形成極少數(shù)轉(zhuǎn)導子，故稱低頻轉(zhuǎn)導。（2）高頻轉(zhuǎn)導雙重溶源菌：同時感染有正常噬菌體和缺陷噬菌體的受體菌。在局限轉(zhuǎn)導中，若對雙重溶源菌進行誘導，就會產(chǎn)生含50%左右的局限轉(zhuǎn)導噬菌體的高頻轉(zhuǎn)導裂解物，用這種裂解物去轉(zhuǎn)導受體菌，就可獲得50%左右的轉(zhuǎn)導子，故稱為高頻轉(zhuǎn)導。3、溶源轉(zhuǎn)變當正常的溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體基因整合到宿主的核基因組上，而使宿主獲得了除免疫性外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。（三）接合(conjugation)供體菌通過性菌毛與受體菌直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。通過接合而獲得新性狀的受體細胞，稱為接合子。E.coli的4種接合型菌株：（1）F+菌株即“雄性”菌株，指細胞內(nèi)存在一至幾個F質(zhì)粒，并在細胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株?？蓪質(zhì)粒通過滾環(huán)復制轉(zhuǎn)入F-菌株中。其中的F質(zhì)粒也可分離或消除。（2）F-菌株即“雌性”菌株，指細胞中無F質(zhì)粒、細胞表面也性菌毛的菌株?？赏ㄟ^與F+菌株或F’菌株的接合而接受供體菌的F質(zhì)?；騀’質(zhì)粒，從而使自己轉(zhuǎn)變成雄性菌株。3）Hfr菌株Hfr是由F因子插入到染色體DNA后形成的高頻重組菌株，因為這類菌株在F因子轉(zhuǎn)移過程中可以把部分甚至全部細菌染色體傳遞給F-細胞并發(fā)生重組而得名,發(fā)生基因重組的頻率比單純用F+

和F-

接合后的頻率高出數(shù)百倍。Hfr菌株仍保持著F+細胞的特征。（4）F’菌株當Hfr菌株細胞內(nèi)的F質(zhì)粒因不正常切離而脫離核染色體組時，可重新形成游離的、但攜帶整合位點鄰近一小段染色體基因的特殊F質(zhì)粒，稱F’質(zhì)粒或F’因子。（四）原生質(zhì)體融合通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質(zhì)體進行融合，借以獲得兼有雙新遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。（一）有性雜交（有性孢子：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、擔孢子）P58指不同遺傳型的兩性細胞間發(fā)生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術。選擇親本菌株——產(chǎn)孢子培養(yǎng)基上，產(chǎn)生子囊——破壁獲得子囊孢子——單倍體子囊孢子密集接觸，產(chǎn)生雙倍體——篩選優(yōu)良菌株（二）準性雜交1、準性生殖：類似于有性生殖，但比之更為原始的兩性生殖方式，是一種在同種而不同菌株的體細胞間發(fā)生的融合，它可不借減數(shù)分裂而導致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。意義：對于尚未發(fā)現(xiàn)有性生殖的但有重要生產(chǎn)價值的半知菌的育種工作提供了一個雜交育種的手段。二、真核微生物的基因重組

2、準性生殖過程（1）菌絲聯(lián)結（體細胞間，頻率低）（2）形成異核體（質(zhì)配）（3）核融合（核配，頻率低）（4）體細胞交換和單倍體化一、基因工程定義：在基因水平上，改造遺傳物質(zhì)，從而使物種發(fā)生變異，創(chuàng)建出具有某種穩(wěn)定新性狀的生物新品系。第四節(jié)基因工程基因工程的基本操作（一）目的基因的取得（二）優(yōu)良載體的選擇（三）目的基因與載體DNA的體外重組（四）重組載體導入受體細胞（五）重組受體細胞的篩選和鑒定（六）“工程菌”和“工程細胞”的大規(guī)模培養(yǎng)微生物學與基因工程的關系：（1）基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成；（2）基因工程所用千余種工具酶絕大多數(shù)是從微生物中分離純化得到；（3）微生物細胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和動物基因工程也要先構建穿梭載體，使外源基因或重組體DNA在大腸桿菌中得到克隆并進行拼接和改造，才能再轉(zhuǎn)移到植物和動物細胞中；（4）大規(guī)模表達各種基因產(chǎn)物，通常都是將外源基因表達載體導入大腸桿菌或是酵母中構建成工程菌，利用工廠發(fā)酵來實現(xiàn)；（5）微生物的多樣性，尤其是抗高溫、高鹽、高堿、低溫等基因，為基因工程提供極其豐富而獨特的基因資源；（6）有關基因結構、性質(zhì)和表達調(diào)控的理論主要也是來自對微生物的研究中取得，因此微生物學不僅為基因工程提供了操作技術同時也提供了理論指導。其它內(nèi)容在《基因工程》課程中詳細學習轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物基因工程：以活的動植物整體代替機械的發(fā)酵罐生產(chǎn)稀有、名貴的醫(yī)用活性肽是當前國際新潮流：乳腺生物反應器、家蠶生物反應器、種子生物反應器、塊莖生物反應器、香蕉口服疫苗等1.衰退（degeneration）：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；第五節(jié)菌種的衰退、復壯及保藏一、菌種的衰退與復壯的概念菌種的復壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法等）。

②通過寄主體內(nèi)生長進行復壯（如Bacillusthuringiensis的復壯）；

③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。

④采用有效的菌種保藏方法。2、菌種的復壯（rejuvenation）：使