栽培杏鮑菇和草魚菌渣堆肥過程中微生物強化的研究

栽培杏鮑菇和草魚菌渣堆肥過程中微生物強化的研究

蘑菇是世界上的第三種細(xì)菌，在中國排名第一，主要分布在中國。草菇的人工栽培起源于我國,在距今300年前就已經(jīng)開始人工栽培,20世紀(jì)30年代才由我國傳入世界各地。隨著草菇人工栽培行業(yè),特別是工廠化栽培的快速發(fā)展,草菇栽培廢棄物也大量產(chǎn)生。然而,如何對草菇栽培菌渣進(jìn)行環(huán)保有效的處理卻一直沒有得到很好的解決。傳統(tǒng)的處理方法是對其進(jìn)行燃燒或丟棄,燃燒只能快速取得其中10%左右的熱能,是對資源的不合理利用,同時也是極大的浪費。筆者曾報道過利用杏鮑菇工廠化栽培的菌渣進(jìn)行草菇再栽培的技術(shù),該技術(shù)已經(jīng)得到產(chǎn)業(yè)化實現(xiàn),但草菇栽培后的菌渣利用問題卻一直難以解決。因為經(jīng)過2種食用菌的栽培生長,每種菌類最高3茬的采收,原有基質(zhì)中較易被利用的營養(yǎng)成分已經(jīng)很少。但本著對生物資源利用最大化和環(huán)境友好的食用菌行業(yè)可持續(xù)發(fā)展原則,仍有可利用價值。本研究利用草菇栽培后的廢棄物為原料,分析經(jīng)杏鮑菇和草菇栽培后的菌渣主要營養(yǎng)成分,考察了菌渣進(jìn)行2種固氮菌和溶磷菌強化的生物堆肥過程中溫度、pH值、E4/E6值對堆肥的影響,堆肥過程中全氮、磷、鉀和速效氮、磷、鉀的動態(tài)變化情況,以期為菌渣廢棄物的“綜合、生態(tài)、循環(huán)、經(jīng)濟”利用提供科學(xué)支撐。1材料和方法1.1固氮菌的獲得堆肥材料為草菇栽培后的菌渣,主要是棉籽殼、木屑、麩皮等的混合物,經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎備用。堆肥發(fā)酵的固氮菌(CGMCC1.233和CGMCC1.142)均來自于中國微生物菌種保藏中心;溶磷菌(ATCC14581和DSM3228)分別來自于美國模式培養(yǎng)物集存庫和德國微生物菌種保藏中心。1.2分析1.2.1測定指標(biāo)及方法各成分的分析均按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定,粗蛋白測定按照GB/T5511—2008;粗脂肪測定按照GB5512—2008;粗纖維測定按照GB6434—86;灰分測定按照GB5505—2008;有機碳測定按照HJ615—2011;全氮測定按照GB/T5511—2008;鈣測定按照GB/T5009.92—2003;磷測定按照GB/T6434—2002。1.2.2ph值、e4/ec值的測定溫度測定:每日定時在堆肥體的上、中、下3點測定堆體溫度2次,取其算數(shù)平均值。pH測定:每日取樣10g,添加無菌水按固液比1∶10混勻,160r/min離心10min,取上清液測定pH值。E4/E6值測定:吸取上述pH測定中的清液在波長465nm和665nm下測定OD值,其比值即為E4/E6值。菌肥有效菌數(shù)測定:在10、30、50、70、100和130d,用稀釋平板計數(shù)法測定有效菌數(shù)。1.2.3全體積肥料的測定、氮、磷、鉀的有效測定速效氮、全氮、全磷和全鉀按照文獻(xiàn)的方法測定,速效磷參照NY/T300-1995、速效鉀參照NY/T301-1995測定。1.3實驗處理設(shè)計及有機肥生產(chǎn)1.3.1堆肥的發(fā)酵及培養(yǎng)將菌種CGMCC1.233、CGMCC1.142、ATCC14581、DSM3228進(jìn)行擴大培養(yǎng)16～24h后,在波長600nm下測定OD值(當(dāng)OD值>0.5,即認(rèn)為活菌數(shù)>108),并用無菌水調(diào)節(jié)使各菌液至OD值相同。每次處理載體150kg,用無菌水50L進(jìn)行浸潤并調(diào)節(jié)濕度,隨后接入調(diào)節(jié)好的菌液30L,充分?jǐn)嚢杌靹?用塑料薄膜覆蓋密封。在密封膜表面均勻扎若干個通氣孔,將堆肥體環(huán)境溫度控制在約28℃保持7d,然后置于常溫下堆肥發(fā)酵即可。堆肥的4種發(fā)酵菌保藏及擴大培養(yǎng)基均采用PDA培養(yǎng)基。對照菌肥制作與接種菌肥相似,區(qū)別為利用自來水調(diào)節(jié)菌肥濕度,不用塑料薄膜覆蓋密封整個堆肥體,整個堆肥管理期調(diào)節(jié)濕度也用自來水調(diào)節(jié)。1.3.2堆肥的保護(hù)堆肥管理:在堆制的第5、18、28、38、48、60d進(jìn)行人工翻堆。在堆置過程中每天觀察水分的散失情況,保持堆肥含水量在50%左右,如果水分過低,立即補水,堆置2個月。采樣:在堆置前及每次翻堆時采樣,從堆體上、中、下3個點進(jìn)行采樣,每個點采樣約200g左右,混合均勻,從中取200g左右,平均分成2份。一份風(fēng)干進(jìn)行含水量測定,一份立即進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。1.3.3堆肥發(fā)酵處理為考察草菇菌渣在不同接種菌處理條件下的溫度、pH、E4/E6值、全氮、磷、鉀和速效氮、磷、鉀的變化情況,本研究將所有堆肥發(fā)酵處理都分為4種,分別為不接種任何菌的自然發(fā)酵對照(CK;下稱:不接菌)、接種2種固氮菌(CGMCC1.233和CGMCC1.142;下稱:N)、接種2種溶磷菌(ATCC14581和DSM3228;下稱:P)和接種所有固氮菌與溶磷菌(CGMCC1.233、CGMCC1.142、ATCC14581和DSM3228;下稱:N+P)。2結(jié)果與討論2.1不同成分的對比試驗結(jié)果為進(jìn)一步綜合利用草菇栽培菌渣,達(dá)到循環(huán)利用的目的,對其進(jìn)行營養(yǎng)成分的分析,揭示草菇栽培菌渣再利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。草菇栽培菌渣的粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、鈣、磷等成分的分析結(jié)果見表1。從表1的結(jié)果可以看出,草菇栽培菌渣的營養(yǎng)成分與稻草相比,有機碳、全氮、粗蛋白和鈣、磷等成分都具有優(yōu)勢,粗脂肪和粗纖維等弱項指標(biāo)差別不大。另一方面,草菇菌渣的碳氮比約為40∶1,這為溶磷菌和固氮菌的生長提供了有利條件,也為實現(xiàn)下一步的堆肥實驗提供了相應(yīng)基礎(chǔ)。因此,將草菇菌渣的鏈?zhǔn)皆倮?無論是從營養(yǎng)成分含量,還是在營養(yǎng)結(jié)構(gòu)上都是可行的。2.2不同菌種堆肥對堆肥溫度的影響堆肥溫度是反映發(fā)酵是否正常的最直接和敏感的指標(biāo)。堆肥過程一般分為升溫階段、高溫階段和降溫階段。一個好的堆肥系統(tǒng),其溫度變化應(yīng)為:堆肥48h之后,堆肥溫度平穩(wěn)上升到約50℃,之后保持在50～60℃之間,期間嚴(yán)禁突破70℃。高溫維持時間的長短反映配方和原料的好壞,理想時間為5～10d,即可殺滅有害病原菌。高溫階段結(jié)束之后是二次發(fā)酵階段,在這一階段難降解有機質(zhì)緩慢分解,堆肥逐漸趨于穩(wěn)定,溫度平穩(wěn)下降。通過試驗測得溫度變化如圖1。從圖1中可以看出,添加2種固氮菌(N)、2種溶磷菌(P)、添加4種強化菌(N+P)和不接菌自然對照,在堆肥48h之后溫度均能達(dá)到50℃并保持了至少5d。因此,草菇菌渣的堆肥處理是可行的,高溫維持時間也較好,滿足堆肥無害化的要求。從圖1中還可看出,接種固氮菌的堆肥系統(tǒng)在發(fā)酵前期溫度上升最快,并在環(huán)境溫度低時,仍能保持較高溫度,這說明固氮菌處理具有較好的保溫作用。對照組在堆肥后期的溫度要高于其他處理,可能是因為在堆肥第14～24d的降溫天氣中,受環(huán)境溫度的影響較大,使得有機質(zhì)沒有得到充分的降解,而在降溫階段,即在二次發(fā)酵期間有機質(zhì)大幅降解,導(dǎo)致溫度再次升高?？偟膩碚f,各處理溫度變化差異不大,不接菌對照相比其他3種接菌強化處理沒有明顯的差異,這就說明自然發(fā)酵能夠在溫度上保證發(fā)酵堆肥的正常進(jìn)行。2.3堆肥對菌體ph值的影響pH值也是影響堆肥效果的重要因素之一,降解有機質(zhì)的微生物大多在pH6.5～8.2的環(huán)境中生長,pH值過高或過低,都會影響堆肥的正常進(jìn)行。在整個堆肥過程中,pH值的變化是含碳有機物所產(chǎn)生有機酸和含氮有機物所產(chǎn)生的氨共同作用的結(jié)果。通過試驗測得pH值變化如圖2。由圖2可知,草菇菌渣堆肥的初期pH值較高,這主要是因為在栽培食用菌的配料中加入了石灰粉,其并未被完全分解。在堆肥初期,由于菌體繁殖較快,產(chǎn)生大量有機酸,導(dǎo)致4個處理的pH值均迅速下降。隨著堆肥的進(jìn)行,部分有機酸隨著溫度升高而揮發(fā)和微生物產(chǎn)生的氨會使pH值又上升,到后期pH緩慢上升并趨于穩(wěn)定,這種變化趨勢是堆體中微生物群落演替和主要代謝產(chǎn)物變化的結(jié)果。4種菌渣堆肥處理相比較,對照因為在發(fā)酵初期18d自然發(fā)酵的微生物種類多、適應(yīng)性強,導(dǎo)致pH下降程度高于其他3種處理,但之后pH差別不大,這就說明自然發(fā)酵就能夠滿足堆肥有機質(zhì)降解所需的pH條件。2.4堆肥的e4/ec由于堆肥的過程伴隨著腐殖化,研究各腐殖化參數(shù)的變化是評價腐熟度的重要方法。腐熟度即堆肥中有機質(zhì)經(jīng)過礦化、腐殖化過程最后達(dá)到穩(wěn)定的程度。本實驗選擇描述腐殖酸品質(zhì)和芳構(gòu)化程度的指標(biāo)E4/E6值來評價堆肥腐殖化作用大小,E4/E6值不與腐殖酸分子數(shù)量有關(guān),而與腐殖酸分子大小與分子的縮和度大小有直接關(guān)系,通常隨腐殖酸分子量的增加或縮和度增大而減小。4種處理堆肥的E4/E6值變化如圖3。由圖3可知,4個處理的E4/E6值總體均呈降低趨勢,符合腐殖化的規(guī)律。在堆肥初期(0～5d)4個處理差異較大,添加2種固氮菌(N)和對照的E4/E6值在5d后快速降低了近0.4,而添加4種菌(N+P)和對照的E4/E6值5d僅降低了約0.1。這說明在堆肥高溫階段,堆肥芳構(gòu)化的速度由快到慢依次為N、CK、P、N+P。在堆肥后熟階段,固氮菌處理的E4/E6值一直保持在最低水平,當(dāng)堆肥進(jìn)行到第46d之后,小分子化合物基本完全轉(zhuǎn)化為大分子化合物,堆肥的腐殖化進(jìn)程基本結(jié)束,E4/E6值趨于穩(wěn)定。通常堆肥接種會加快腐殖化進(jìn)程,但是與對照組相比,除了固氮菌處理有明顯的加快腐殖化的作用以外,其余3個處理的變化均不是很明顯,這些都說明不接菌的自然發(fā)酵對照就能夠滿足草菇堆肥腐殖化的要求。2.5各堆肥對各菌種初步堆肥的各療效磷含量的影響在堆肥過程中,氮素被認(rèn)為是影響微生物生長及其活性的限制性因素。微生物利用堆肥原料的有機物質(zhì)合成自生細(xì)胞物質(zhì),同時堆肥原料中的難降解成分被降解。因此有必要對菌渣堆肥過程中的全N、P、K和速效N、P、K的變化進(jìn)行分析,如圖4。由圖4可知,堆肥過程中全氮含量的變化差異不大,整體呈增加趨勢,最高增加了79.91%(不接菌);全磷含量在堆肥結(jié)束時為對照組>N>P>N+P,分別比堆肥初期增加了132.62%、125.53%、14.89%和12.06%;全鉀在堆肥初期呈上升趨勢,之后下降速度各有不同,在堆肥結(jié)束時,對照組、溶磷菌(P)、4種菌(N+P)處理的鉀含量分別下降了5.79%、7.37%、8.95%,而固氮菌(N)處理則增加了2.11%。由圖4還可見,在堆肥初期,速效氮含量在第5d時達(dá)最高,之后下降,第48d后又開始上升。這種變化說明:堆肥初期,在微生物的作用下,原料中易降解有機物質(zhì)劇烈降解,有機態(tài)的氮素通過氨化作用轉(zhuǎn)變?yōu)殇@態(tài)氮和酰胺態(tài)氮,這構(gòu)成了堆肥初期速效氮的主體。之后氨化作用和硝化作用同時進(jìn)行,銨態(tài)氮降低、硝態(tài)氮升高,同時由于高溫作用,一部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔?因而速效氮含量略微下降。在堆肥46d時,微生物的硝化作用逐漸占主導(dǎo),氨化作用逐漸停止,硝態(tài)氮的增加使得速效氮含量又呈上升趨勢。在整個堆肥中,各個處理的速效磷含量曲折上升,沒有明顯的規(guī)律性差異。在結(jié)束時,各處理的速效磷含量分別增長了214.63%(2種溶磷菌P)、197.56%(4種菌N+P)、173.17%(CK)和170.73%(2種固氮菌N)。速效磷的增加主要由于堆肥初期微生物大量增殖,大量有機磷轉(zhuǎn)化為微生物的細(xì)胞質(zhì),存儲于核酸、磷酸等中,但隨著微生物的生長消亡,這些有機磷被轉(zhuǎn)化為可被植物吸收的速效磷;其二是通過解磷微生物對有機磷的礦化和無機磷的溶解,使菌糠中的磷轉(zhuǎn)化成速效磷。4個處理在堆肥過程中速效K含量變化差異總體不如速效氮和速效磷顯著,但也呈現(xiàn)上升趨勢,分別比堆肥初期增長了36.22%(2種溶磷菌)、34.65%(2種固氮菌)、29.13%(CK)、16.54%(4種混合菌)。綜上所述,4種處理的堆肥體全氮、磷、鉀和速效氮、磷、鉀含量的變化情況沒有明顯的規(guī)律,之間互有交叉,不接菌的草菇菌渣堆肥體沒有顯著的劣勢,這就為自然發(fā)酵提供了科學(xué)的支撐。3菌渣添加固氮菌和溶磷菌通過對經(jīng)杏鮑菇和草菇工廠化2次栽培后的菌渣成分分析發(fā)現(xiàn),菌渣的有機碳、全氮、鈣、磷和粗蛋白等含量較高,特別是碳氮比約為40∶1,相比普