成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的反應(yīng)

成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的反應(yīng)

神經(jīng)恢復(fù)的重要性不僅包括神經(jīng)系統(tǒng)的重建和突變，還包括相關(guān)環(huán)境的重建和神經(jīng)功能的恢復(fù)。多年來一直認(rèn)為外周神經(jīng)損傷后可以再生,而成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后不能再生。為什么中樞神經(jīng)不能再生?神經(jīng)科學(xué)工作者從各個(gè)層次和角度對(duì)這一問題進(jìn)行了探討和闡述,以求明確其發(fā)生機(jī)理,從而指導(dǎo)中樞神經(jīng)的人工輔助再生。1.再生軸突后的細(xì)胞激活早在1928年,Cajal就觀察到神經(jīng)損傷后的長(zhǎng)芽現(xiàn)象。外周神經(jīng)損傷后的反應(yīng)主要包括Walleri變性和節(jié)段性脫髓鞘(segmentaldemyelination):神經(jīng)元因?yàn)槭ヅc終末器官的聯(lián)系,軸突遠(yuǎn)端和髓鞘崩解;大量巨噬細(xì)胞侵入,清除軸突和髓鞘的碎屑,同時(shí)激活Schwann細(xì)胞分裂增生,沿神經(jīng)纖維的內(nèi)膜排列成柱狀,形成Büngner細(xì)胞帶(bandsofBüngner);再生軸突通過Büngner細(xì)胞帶延伸到支配器官,同時(shí)髓鞘形成。CNS損傷后的反應(yīng)主要是:神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和軸突髓鞘的崩解;被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞分裂增生,在損傷的組織表面形成膠質(zhì)瘢痕;小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,吞噬崩解產(chǎn)物。隨著對(duì)神經(jīng)損傷后反應(yīng)過程的了解,人們逐漸認(rèn)識(shí)到周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)和CNS損傷后軸突和髓鞘的反應(yīng)是相同的,而損傷部位周圍環(huán)境的細(xì)胞反應(yīng)是不同的。PNS損傷后由Schwann細(xì)胞構(gòu)成的Büngner細(xì)胞帶引導(dǎo)新生軸突的生長(zhǎng),大量巨噬細(xì)胞可以及時(shí)清除軸突和髓鞘的碎屑。CNS損傷后由星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的膠質(zhì)瘢痕則是阻礙再生纖維通過的物理屏障,而且激活小膠質(zhì)細(xì)胞是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程,這使得損傷部位髓鞘和軸突的崩解產(chǎn)物不能被及時(shí)清除。長(zhǎng)期以來人們一直認(rèn)為星形膠質(zhì)瘢痕是抑制CNS再生的主要因素,近年來這種觀點(diǎn)發(fā)生了改變。2.神經(jīng)生長(zhǎng)抑制物在損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的過程中少突膠質(zhì)細(xì)胞不是主要的反應(yīng)細(xì)胞,盡管它們?cè)趽p傷后也增生,但是這種反應(yīng)卻是一過性的。早期的研究者亦指出PNS之所以能夠再生,其組織環(huán)境是十分重要的因素,20世紀(jì)80年代Aguago研究組證實(shí)CNS大多數(shù)投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的受損軸突都能在周圍神經(jīng)的環(huán)境中再生。這個(gè)現(xiàn)象促使人們?nèi)ヌ接慞NS和CNS再生差別的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,結(jié)果提出了神經(jīng)生長(zhǎng)抑制物(neuritegrowthinhibitor)的概念。研究人員將神經(jīng)元與坐骨神經(jīng)及視神經(jīng)共培養(yǎng),結(jié)果神經(jīng)元的突起可以長(zhǎng)入坐骨神經(jīng)而不能長(zhǎng)入視神經(jīng),似乎表明成年CNS組織中存在抑制神經(jīng)再生的物質(zhì)。用CNS不同腦區(qū)的冰凍切片作為培養(yǎng)神經(jīng)元的基質(zhì),神經(jīng)元能附著在灰質(zhì)上生長(zhǎng)形成突起,卻不能在白質(zhì)上生長(zhǎng)。成年雞的背根節(jié)神經(jīng)元可以在含有l(wèi)aminin的環(huán)境中生長(zhǎng),但是不能在含有CNS髓鞘的環(huán)境中生長(zhǎng)。越來越多的實(shí)驗(yàn)表明少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘中含有抑制神經(jīng)再生的物質(zhì)。髓鞘的化學(xué)組分是髓磷脂,髓磷脂的生化組成比較簡(jiǎn)單,脂類占干重的70%~80%,蛋白占15%~30%,神經(jīng)節(jié)苷脂占5%~10%。CNS的髓磷脂蛋白以蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)和髓鞘堿性蛋白(MBP)居多,兩者共占約80%,此外含有少量的髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)(約占1%)和中樞神經(jīng)特異的少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)。近年來證實(shí)MAG和OMgp有很強(qiáng)的抑制軸突再生的作用。PNS的髓磷脂蛋白50%以上是P0蛋白,P2蛋白和MBP約占15%~20%。P0蛋白和周圍髓鞘蛋白22(PMP22)為PNS所特有的脂蛋白,二者在Schwann細(xì)胞的正常發(fā)育和髓鞘形成過程中發(fā)揮作用。2.1mag與ngo-66的相互作用MAG是免疫球蛋白超家族成員,定位于中樞和周圍神經(jīng)髓鞘的軸突周圍區(qū),髓鞘板層內(nèi)無MAG。大鼠的MAG基因有13個(gè)外顯子,MAG分子的細(xì)胞外區(qū)含有RGD三肽序列,可以和細(xì)胞表面整合素受體結(jié)合,因此認(rèn)為MAG的生理功能可能是在髓鞘形成的過程中起細(xì)胞識(shí)別和粘附的作用。在PNS,MAG是調(diào)節(jié)有髓神經(jīng)纖維成熟和生長(zhǎng)的信號(hào)分子。近年的許多研究表明MAG對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元有很強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用,但是對(duì)MAG缺陷小鼠的研究卻顯示其抑制神經(jīng)生長(zhǎng)的能力與野生型鼠并無顯著差別。2003年Wong等將胚胎16d大鼠的視神經(jīng)切斷后,用激光使視神經(jīng)表面的MAG失活,一段時(shí)間后神經(jīng)可生長(zhǎng)并跨過損傷部位,經(jīng)神經(jīng)殘端吸收的逆行標(biāo)記物可出現(xiàn)在損傷部位另一端。目前的研究結(jié)果傾向于MAG是抑制CNS再生的重要物質(zhì)。2002年Filbin研究組發(fā)現(xiàn)MAG可以和Nogo受體(NgR)結(jié)合抑制軸突的生長(zhǎng),而且MAG和Nogo對(duì)NgR的結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的。幾乎在同時(shí),Strittmatter實(shí)驗(yàn)室采用Cos-7細(xì)胞表達(dá)鼠腦cDNA文庫及融合蛋白的方法揭示:MAG是Nogo-66受體的一個(gè)功能性配體,但是MAG和Nogo-66結(jié)合在NgR分子相同功能區(qū)域的不同位點(diǎn)上,二者屬于非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。MAG和NgR都是在出生后的早期開始表達(dá)。2.2ogmp基因早先有人從牛腦組織髓鞘中純化出一種蛋白,因其對(duì)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)具有抑制作用,就將其稱為arretin,后來證實(shí)其主要成分就是OMgp。OMgp是一種CNS特異性糖蛋白,大約只占髓磷脂蛋白的0.05%,定位在髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞體的外表面。在發(fā)育期,它的出現(xiàn)比其他髓磷脂蛋白晚,其生理功能可能是在髓鞘形成的過程中與終止信號(hào)的發(fā)出有關(guān)。OMgp疑是引起某些自身免疫性疾病(如多發(fā)性硬化)的靶抗原。OMgp是少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白,含有433個(gè)氨基酸殘基。1990年研究人員用編碼OMgp的cDNA克隆篩選人基因組DNA文庫,得到了人OMgp基因。通過基因組克隆與分裂中期細(xì)胞雜交,將人的OMgp基因定位于17號(hào)染色體的q11~12處,此位置正是神經(jīng)纖維瘤1型基因(NF1)的所在區(qū)域。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示OMgp基因是NF1基因的一個(gè)內(nèi)含子,過表達(dá)OMgp的NIH3T3細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減緩,細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在G1期受阻,OMgp可阻礙有絲分裂信號(hào)途徑而發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用。體外培養(yǎng)條件下OMgp對(duì)多種神經(jīng)細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用,如大鼠海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞、視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及NG108和PC12細(xì)胞系等。將OMgp和背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)可觀察到明顯的生長(zhǎng)錐崩解現(xiàn)象。2002年Wang等發(fā)現(xiàn)OMgp和NgR有較高的親和力,去除細(xì)胞表面的NgR等GPI錨定蛋白,背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元對(duì)OMgp的生長(zhǎng)抑制作用失去敏感性,而加入外源性NgR又可使其對(duì)OMgp的敏感性恢復(fù),這說明OMgp是NgR的一個(gè)功能性配體。2.3nogo-b和nogo-cNogo的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)再生研究的里程碑。1988年Schawb研究組從大鼠脊髓髓鞘中分離出分子質(zhì)量分別為35kD(NI35)和250kD(NI250)的蛋白,這兩種蛋白對(duì)軸突生長(zhǎng)都有很強(qiáng)的抑制作用。其特異性抗體能和這兩種蛋白結(jié)合,并拮抗髓鞘崩解產(chǎn)物對(duì)軸突再生的抑制作用。2000年,得益于對(duì)牛的bNI220蛋白(NI-250的同源物)六個(gè)肽段的分析,三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)報(bào)告了一個(gè)未知基因——nogo基因,它編碼這種抑制性蛋白質(zhì)。nogo的表達(dá)產(chǎn)物稱為Nogo蛋白,Nogo蛋白是CNS髓鞘中具有抑制神經(jīng)生長(zhǎng)活性的跨膜蛋白。由于啟動(dòng)子與mRNA剪切位置不同,Nogo蛋白分為三種同型異構(gòu)體:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。人的Nogo-A由1192個(gè)氨基酸殘基組成,相當(dāng)于大鼠的NI-250;Nogo-B相當(dāng)于大鼠的NI-35;Nogo-C是以前所描述的大鼠的vp20和foocen-s。Nogo-A主要分布于少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,少量位于少突膠質(zhì)細(xì)胞表面,在某些神經(jīng)元膜上或細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá),星形膠質(zhì)細(xì)胞和Schwann細(xì)胞中未見分布。Nogo-B和Nogo-C的分布較廣泛,除CNS外,在軟骨、皮膚及骨骼肌細(xì)胞中均有分布,目前對(duì)Nogo-B及Nogo-C是否具有抑制作用尚有爭(zhēng)議。Nogo蛋白有兩個(gè)完全獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:Nogo-66和amino-Nogo,Nogo-66是指兩個(gè)疏水區(qū)之間的序列,amino-Nogo包括從Nogo氨基端到第一個(gè)疏水區(qū)的氨基酸序列。Strittmatter實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果證實(shí)Nogo-66和amino-Nogo都具有獨(dú)立的抑制活性。Nogo-66在體內(nèi)是通過與其受體NgR相結(jié)合而發(fā)揮作用的。2001年Alyson等用堿性磷酸酶融合蛋白篩選基因表達(dá)文庫的方法鑒定出一種和Nogo-66有高親和力的蛋白,將編碼此種蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染入早期雞胚的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞使其表達(dá),在該發(fā)育階段細(xì)胞對(duì)Nogo-66不敏感,當(dāng)加入外源性的Nogo-66后生長(zhǎng)錐潰變,表明此種蛋白是Nogo-66的功能性受體。NgR主要表達(dá)于CNS的神經(jīng)元及軸突表面。NgRcDNA序列編碼的蛋白長(zhǎng)度為473個(gè)氨基酸,帶有典型的氨基端易位信號(hào)序列。信號(hào)序列后接有8個(gè)亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)和一個(gè)LRRC-末端(LRRCT),其分子的C-端借助GPI錨定蛋白固定在質(zhì)膜的外表面。經(jīng)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)處理,去除GPI的胚胎背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,其生長(zhǎng)錐不再受Nogo-66的抑制,但GPI并非NgR的功能區(qū)域。兩種髓鞘抑制蛋白MAG及OMgp與NgR均有很高的親和力。MAG、OMgp和Nogo-66對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)抑制作用都需要NgR的介導(dǎo),NgR的表達(dá)使得對(duì)MAG、OMgp和Nogo-66不敏感的神經(jīng)元轉(zhuǎn)為敏感狀態(tài),相反,amino-Nogo卻不能和NgR結(jié)合。進(jìn)一步研究揭示,這三種抑制分子都結(jié)合在NgR亮氨酸重復(fù)序列富集區(qū)。MAG、和Nogo-66結(jié)合于NgR的不同位點(diǎn)上,而Nogo-66與OMgp在NgR上的結(jié)合位點(diǎn)有重疊,故二者存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。NgR似乎是CNS中諸多抑制分子發(fā)揮作用的集中點(diǎn)。更有資料表明脊髓損傷后,NgR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑NEP1-40能明顯促進(jìn)受損神經(jīng)軸突生長(zhǎng)及功能恢復(fù)。由于NgR是細(xì)胞表面的錨定蛋白,分子序列中不存在跨膜的成分,因此最先猜想它需要一個(gè)跨膜的復(fù)合受體來介導(dǎo)NgR的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。最近兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到的p75NTR極有可能就是NgR的復(fù)合受體亞單位。已知p75NTR是神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體即酪氨酸激酶受體trk家族的一種復(fù)合受體,用神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以阻斷MAG對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。但是在p75NTR突變鼠,MAG依賴的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制作用可被消除,看來似乎p75NTR的作用自相矛盾。p75NTR被激活后,與細(xì)胞內(nèi)的一種小型G蛋白即小鳥嘌呤核苷三磷酸酶(smallGTPases)的Rho家族成員RhoA結(jié)合,經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,最終抑制神經(jīng)再生。用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子提高神經(jīng)元內(nèi)cAPM水平,激活PKA,使Rho磷酸化而失活,可以阻斷髓鞘對(duì)軸突生長(zhǎng)的抑制作用。3.星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)再生的影響RioHortega(1918)用改良的Golgi鍍銀技術(shù),將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為三種類型:(1)輻射狀星形膠質(zhì)細(xì)胞,分布在垂直于腦室軸的平面上,跨越整個(gè)白質(zhì)的厚度,主要存在于發(fā)育時(shí)期;(2)纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞,多分布在白質(zhì);(3)原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞,多居于灰質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在CNS發(fā)育和正常生理功能的維持以及病理反應(yīng)中均具有重要的作用。CNS損傷后會(huì)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大增生,稱為“反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞”(reactiveastrocytes),此時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)上調(diào)。研究表明反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生主要局限于損傷區(qū)域,而且增生細(xì)胞主要來源于損傷周圍區(qū)細(xì)胞的遷移,只有1%~6%的細(xì)胞是分裂復(fù)制而來的。關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)再生的影響,目前認(rèn)為有以下幾種可能性:(1)阻止形成正常的軸突生長(zhǎng)支撐基礎(chǔ);(2)阻止產(chǎn)生軸突生長(zhǎng)促進(jìn)因子;(3)產(chǎn)生抑制軸突生長(zhǎng)的活性因子。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示新生的星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞遷移和軸突生長(zhǎng)的良好基質(zhì),而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞則不支持神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。對(duì)于CNS損傷后由星形膠質(zhì)細(xì)胞所形成的膠質(zhì)瘢痕是否是神經(jīng)再生機(jī)械屏障的問題存在爭(zhēng)議,有研究顯示大鼠扣帶和冬眠松鼠脊髓損傷后沒有膠質(zhì)瘢痕的形成,但神經(jīng)卻同樣不能再生。因此,近年來的研究結(jié)果傾向于膠質(zhì)瘢痕不是通過機(jī)械屏障的作用來阻礙再生的。星形膠質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)某些細(xì)胞粘附分子(CAM)和基質(zhì)粘附分子(SAM),合成和分泌某些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞粘附分子主要有神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、神經(jīng)-鈣粘附蛋白(N-cadherin)和膠質(zhì)細(xì)胞源性連接蛋白(glia-derivednexin,GDN)。星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)粘附分子有層粘連蛋白(laminin,LN)和某些蛋白多糖(proteoglycan)和糖蛋白,如硫酸軟骨素蛋白聚糖(CS-PG)、硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖(KS-PG)、tenascin(TN)和janusin等。星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的生長(zhǎng)因子有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等。此外星形膠質(zhì)細(xì)胞還分泌IL-1、IFN-γ和TNF等細(xì)胞因子,在免疫和炎癥反應(yīng)中起作用。3.1星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性在正常狀態(tài)下,成年CNS膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)或僅低水平表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF),但在損傷情況下,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞合成這類分子的能力增強(qiáng)。脊髓損傷部位加入外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)可促進(jìn)軸突再生,經(jīng)基因工程改造、可分泌NGF的成纖維細(xì)胞植入CNS損傷部位后有大量神經(jīng)軸突長(zhǎng)入。然而,一旦離開了這塊營(yíng)養(yǎng)綠洲,軸突的生長(zhǎng)即告停止。被包括損傷在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病激活的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)NGF受體TrkA,因此可能存在這樣一種情況,損傷引起星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NGF,而NGF又被自身受體結(jié)合,不能被神經(jīng)細(xì)胞和軸突攝取而發(fā)揮作用,這種情況被稱為“分子海綿”(molecularsponge)。層粘蛋白(laminin,LN)是一種高分子量細(xì)胞外間質(zhì)糖蛋白,由3個(gè)亞單位組成,一條4×105μ的A鏈及兩條2×105μ的B鏈。在發(fā)育過程中,LN只在CNS短暫表達(dá),到發(fā)育晚期或成熟期其表達(dá)下降,成年哺乳動(dòng)物的CNS無LN的表達(dá)。在體外培養(yǎng)時(shí),LN對(duì)外周神經(jīng)和某些中樞神經(jīng)元的生長(zhǎng)有強(qiáng)大的促進(jìn)作用,但不能促進(jìn)神經(jīng)元的存活。用抗LN的抗體阻斷后可以減慢和延緩軸突的生長(zhǎng)和成熟,但并不阻斷軸突的長(zhǎng)出。CNS損傷以后,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞開始具有分泌LN的能力,損傷后24h,GFAP陽性細(xì)胞中即可檢測(cè)到LN的存在,4d以后,大部分反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞均呈LN陽性,LN是星形膠質(zhì)瘢痕的成分,說明星形膠質(zhì)細(xì)胞有分泌LN的潛力,在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境刺激下可產(chǎn)生LN,促進(jìn)神經(jīng)再生。轉(zhuǎn)染小鼠GFAPcDNA的成纖維細(xì)胞與大鼠的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng),分析其產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)其中含有大量LN,由此得出分泌GFAP的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能夠產(chǎn)生LN,促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。與此相反,近來有人用反義GFAPmRNA處理CNS損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞,阻礙其合成膠質(zhì)原纖維,然后將其與神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其仍舊可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng),經(jīng)測(cè)定培養(yǎng)基質(zhì)中LN的含量升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞合成GFAP和產(chǎn)生LN似無相關(guān)性。3.2cs-pg對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)的影響蛋白聚糖被認(rèn)為是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一類軸突生長(zhǎng)抑制分子。蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)蛋白質(zhì)核心,其表面連接著稱為氨基聚糖(glycosaminoglycans,GAGs粘多糖)的糖基成分。糖基成分包括硫酸軟骨素(CS)、硫酸肝素(HS)、硫酸皮膚素(DS)和硫酸角質(zhì)素(KS)等。CNS損傷后蛋白聚糖的表達(dá)上調(diào),提示這些分子參與再生抑制環(huán)境的形成。硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitinsulfateproteoglycans,CS-PG)在發(fā)育及成年期大鼠CNS中廣泛表達(dá),脊髓損傷以后在CNS的細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)上調(diào)。根據(jù)其核心蛋白成分及所含糖基的不同,CS-PG可分為許多類,包括neurocan,brevican,phosphacan和versican等。Neurocan,brevican和versican是結(jié)合有透明質(zhì)酸的aggrecan家族成員。經(jīng)對(duì)各種組織的檢測(cè)分析表明,neurocan和phosphacan在胚胎和成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)特異表達(dá)。Neurocan主要由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生,phosphacan由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,近來也有報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生neurocan。體外實(shí)驗(yàn)中neurocan和phosphacan可被Ng-CAM/L1觸發(fā)產(chǎn)生軸突生長(zhǎng)抑制作用,而且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。有實(shí)驗(yàn)觀察到CS-PG可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的樹突而不是軸突生長(zhǎng),這和神經(jīng)細(xì)胞在反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)上的生長(zhǎng)現(xiàn)象是一致的。聯(lián)系neurocan和phosphacan在神經(jīng)生長(zhǎng)活躍的部位表達(dá),在正常情況下似乎不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為它們是抑制或促進(jìn)生長(zhǎng)的分子,而是通過細(xì)胞表面不同的受體發(fā)揮不同的作用。125I標(biāo)記的neurocan和phosphacan都能結(jié)合到神經(jīng)元表面,抗Ng-CAM和N-CAM的抗體可以阻斷二者的結(jié)合,提示神經(jīng)細(xì)胞表面的Ng-CAM及N-CAM是neurocan和phosphacan的功能性配體。Phosphacan被去除硫酸軟骨素鏈的核心蛋白后仍具有軸突生長(zhǎng)抑制能力,表明硫酸軟骨素鏈不參與其抑制功能單位。Versican在胚胎組織中選擇表達(dá),對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞還表達(dá)一種硫酸軟骨素蛋白聚糖biglycan,其核心蛋白序列富含亮氨酸,可以促進(jìn)新皮質(zhì)神經(jīng)元的存活生長(zhǎng)。CNS損傷后,主要由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的膠質(zhì)瘢痕中富含蛋白聚糖。體外培養(yǎng)加入這些蛋白聚糖時(shí),神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞都不易粘附,且限制細(xì)胞的遷移和神經(jīng)突起的生長(zhǎng),用相應(yīng)抗體可以阻斷蛋白聚糖的抑制作用。Emerling的實(shí)驗(yàn)表明蛋白聚糖也可通過調(diào)節(jié)某些未知的細(xì)胞因子發(fā)揮作用,說明膠質(zhì)瘢痕中的蛋白聚糖通過直接和間接兩個(gè)途徑起到神經(jīng)生長(zhǎng)抑制作用。此外,星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的糖蛋白如tenascin和janusin,在體外實(shí)驗(yàn)中都有限制細(xì)胞遷移和抑制神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用,但是它們?cè)谏窠?jīng)發(fā)生中的作用正相反。4.組織化學(xué)染色小膠質(zhì)細(xì)胞遍布整個(gè)CNS,約占膠質(zhì)細(xì)胞的5%~20%。小膠質(zhì)細(xì)胞的表型使其很容易與其他膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)別,在大鼠可用能結(jié)合CR3補(bǔ)體受體的單克隆抗體OX42識(shí)別小膠質(zhì)細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞也是腦內(nèi)表達(dá)MHC抗原的主要細(xì)胞。此外,因大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞表面都有不同程度的糖基化,用凝集素(如isolectinB4)組織化學(xué)染色也能顯示之,此方法可能是最容易和可靠的方法。關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞是中胚層還是外胚層起源的問題至今仍懸而未決。小膠質(zhì)細(xì)胞與非神經(jīng)組織的巨噬細(xì)胞具有相同的表面Fc和CR3補(bǔ)體受體,其胞質(zhì)含有溶酶體、非特異性酯酶和過氧化物酶等單核巨噬細(xì)胞的特異性物質(zhì)。因此中胚層起源假說認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞起源于中胚層的單核巨噬細(xì)胞系,在胚胎發(fā)育早期進(jìn)入CNS轉(zhuǎn)變?yōu)樾∧z質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)外胚層起源的觀點(diǎn)認(rèn)為,小膠質(zhì)細(xì)胞來源于共同的成膠質(zhì)細(xì)胞(glioblast),小膠質(zhì)細(xì)胞譜系是成膠質(zhì)細(xì)胞譜系的一個(gè)組分。目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞是特化的免疫活性細(xì)胞,形成腦的局部免疫系統(tǒng)。病理情況下被激活的部分反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬能力。神經(jīng)元碎屑、出血和死亡細(xì)胞是引起反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞增生的強(qiáng)烈信號(hào)。除吞噬作用外,小膠質(zhì)細(xì)胞可以呈遞抗原給T細(xì)胞,參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此小膠質(zhì)細(xì)胞不但是腦的巨噬細(xì)胞,也是CNS的抗原呈遞細(xì)胞。4.1特殊的抗炎作用正常情況下小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)CNS起保護(hù)作用,CNS損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種形態(tài)及功能的變化,包括形態(tài)學(xué)、細(xì)胞數(shù)量、表面受體以及生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)。此時(shí)細(xì)胞展示出新的動(dòng)力學(xué)特征,具備增殖和遷移能力,同時(shí)膜受體密度增高,呈現(xiàn)強(qiáng)大的吞噬作用。除原有受體表達(dá)增強(qiáng)外,此時(shí)細(xì)胞尚表達(dá)一些靜止小膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)的產(chǎn)物,如波形纖維蛋白(vimentin)和MHC-Ⅰ(鼠為OX-18)。體外研究指出,吞噬信號(hào)、γTNF、lectin和脂多糖(LPS)都可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞改變形態(tài),出現(xiàn)表面標(biāo)記或趨化性反應(yīng)。體外研究揭示,小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌生長(zhǎng)因子,如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、NGF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor,TGF),這些物質(zhì)對(duì)損傷后神經(jīng)的再生具有促進(jìn)作用。研究表明CNS損傷后1周內(nèi),在損傷部位及其周緣即有小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大量增生,在損傷部位的邊緣被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GDNF和BDNF,此時(shí)損傷的軸突長(zhǎng)芽,長(zhǎng)出突起,但是軸突再生的距離僅限于有生長(zhǎng)因子表達(dá)的損傷部位周緣。小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌許多細(xì)胞因子,如IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等,其中IL-1β和TNF屬于促炎性細(xì)胞因子,IL-10和TGF-β屬于抗炎性細(xì)胞因子,IL-6可促進(jìn)NGF的產(chǎn)生,在CNS損傷后促進(jìn)組織的修復(fù),IL-1β和TNF-α可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)NT。CNS損傷后,損傷部位的周圍即有IL-1β和TNF-α表達(dá)的上調(diào),這種細(xì)胞因子的改變可能是局部炎癥反應(yīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的因素。TGF可以抑制損傷后IL-1β的表達(dá),TNF則不能。小膠質(zhì)細(xì)胞還能對(duì)一些生長(zhǎng)因子,如粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和集落刺激因子-1(CSF-1)起反應(yīng),此二者是小膠質(zhì)細(xì)胞繁殖的強(qiáng)大誘導(dǎo)物。此外,由于因?yàn)轶w外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞可以釋放蛋白聚糖,故小膠質(zhì)細(xì)胞還可能分泌某些蛋白聚糖,對(duì)神經(jīng)再生起抑制作用。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是腦損傷后前列腺素E2(PGE2)的主要來源。現(xiàn)己證明PGE2是一種抗炎分子。PGE2被證明可保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受缺氧/再灌注損傷、谷氨酸誘導(dǎo)的損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞毒性產(chǎn)物的損傷,其保護(hù)作用是通過升高cAMP來實(shí)現(xiàn)的。PGE2可抑制巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,提示PGE2在CNS中起抗炎作用。損傷部位小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集伴隨著局部NO含量的升高,在小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的早期即有NO的作用,NO被認(rèn)為是小膠質(zhì)細(xì)胞聚集的終止信號(hào)。尚沒有明確的答案解釋是什么因素啟動(dòng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,現(xiàn)認(rèn)為部分因素可能來自于神經(jīng)元。這種信號(hào)的本質(zhì)有人認(rèn)為是ATP,小膠質(zhì)細(xì)胞膜上存在嘌呤受體,培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞加入ATP后,可誘導(dǎo)其產(chǎn)生復(fù)合膜電位和跨膜Ca2+內(nèi)流,并通過嘌呤受體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1,激活補(bǔ)體系統(tǒng),補(bǔ)體系統(tǒng)隨著IL-1的表達(dá)進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞。4.2化學(xué)免疫因子反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和血液來源的巨噬細(xì)胞共同參與CNS損傷后的炎癥反應(yīng),二者的比例取決于損傷的類型和嚴(yán)重程度。有人認(rèn)為血液來源的巨噬細(xì)胞主要參與CNS的機(jī)械性損傷,而反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞主要參與化學(xué)性損傷。研究表明損傷后的炎癥反應(yīng)是造成CNS繼發(fā)性損害的原因,而激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的化學(xué)因子是細(xì)胞毒物質(zhì)的來源。原位注射zymoson激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞后,在注射針道周圍可造成組織的繼發(fā)性損傷,引起神經(jīng)細(xì)胞脫髓鞘等永久性損害。在損傷原位阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,可以保護(hù)神經(jīng)元免受繼發(fā)性損害,提高軸突再生能力。但是也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明炎癥對(duì)損傷的修復(fù)有積極作用,損傷局部使用促炎物質(zhì)對(duì)再生有利。在炎癥過程中,小膠質(zhì)細(xì)胞既可分泌抗炎性細(xì)胞因子,也可分泌促炎性細(xì)胞因子;既可分泌生長(zhǎng)因子保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng),又產(chǎn)生細(xì)胞毒物質(zhì)損害神經(jīng)細(xì)胞。因此,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性的雙重作用,其作用取決于促炎功能與抗炎功能之間的平衡。損傷發(fā)生后軸突和髓鞘的崩解產(chǎn)物中有許多細(xì)胞毒物質(zhì),小膠質(zhì)細(xì)胞是這些物質(zhì)的清除機(jī)器。在CNS損傷的早期,具有吞噬能力的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞被極度抑制,因而不能及時(shí)有效地去除軸突和髓鞘的碎片和崩解產(chǎn)物,從而使得神經(jīng)再生困難,迄今抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力的具體機(jī)制尚未明了。5.c-東南角蛋白mrna的激活和激活再生相關(guān)基因指的是在神經(jīng)元受損傷后發(fā)生變化、影響神經(jīng)再生的那些神經(jīng)元內(nèi)在的基因。CNS損傷后由膠質(zhì)細(xì)胞及胞外基質(zhì)構(gòu)成的環(huán)境是神經(jīng)能否再生的外因,而再生相關(guān)基因活性及其表達(dá)產(chǎn)物是決定能否再生的內(nèi)因。與再生有關(guān)的神經(jīng)元自身的因素包括:損傷信號(hào)向神經(jīng)元胞體逆行運(yùn)輸及啟動(dòng)生長(zhǎng)狀態(tài)的能力,編碼與生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞骨架成分基因的重新表達(dá),GAP-43的表達(dá),以及順行運(yùn)輸生長(zhǎng)物質(zhì)的能力。在發(fā)育時(shí)期,神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)需要actin、tubulin和neurofilament等細(xì)胞骨架蛋白的合成和運(yùn)輸,CNS損傷后也會(huì)出現(xiàn)這些重要骨架蛋白合成和運(yùn)輸?shù)淖兓?。面神?jīng)損傷后,集中于面神經(jīng)核的神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)actin和tubulin顯著上調(diào),而neurofilament表達(dá)下調(diào)。Neurofilament合成的下調(diào)可能會(huì)去除某些因素對(duì)其他骨架蛋白運(yùn)輸?shù)南拗?使新合成的蛋白質(zhì)更容易到達(dá)裝配部位。骨架蛋白的合成總是和軸突再生的過程相伴隨,是軸突再生的必要條件,因此編碼神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白合成及裝配的基因,如c-jun、gap和cap的活性都與再生能力有關(guān)。目前還不清楚骨架蛋白合成障礙是否是再生困難的主要原因。在PNS,坐骨神經(jīng)損傷后相應(yīng)的背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)即有c-jun基因mRNA及其表達(dá)產(chǎn)物的迅速上調(diào),而且c-jun基因表達(dá)上調(diào)的時(shí)間和損傷部位與神經(jīng)元胞體的距離有關(guān),距離越短則基因上調(diào)越早,提示c-jun基因激活需要損傷信號(hào)分子從損傷部位向神經(jīng)元胞體逆行運(yùn)送。研究表明CNS損傷部位和神經(jīng)元胞體的距離越遠(yuǎn),由損傷部位向胞體的逆行運(yùn)輸能力越差,說明CNS也存在相同的機(jī)制。由損傷信號(hào)觸發(fā)的神經(jīng)元代謝能力的提高是損傷后神經(jīng)元再生的前提。nGAPs(neuronalgrowth-associatedproteins)是神經(jīng)元特異基因gap表達(dá)的一組蛋白產(chǎn)物,是神經(jīng)生長(zhǎng)因子激活靶基因后的下游物質(zhì),與神經(jīng)生長(zhǎng)和再生密切相關(guān)。nGAPs包括GAP-43、SCG-10(supercervicalganglion-10)