獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)：病原微生物分子檢測及分子分型

病原微生物的分子檢測及分子分型浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院方維煥教授方春博士生分子診斷技術(shù)分子分型溯源技術(shù)Contents聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)核酸分子雜交技術(shù)噬菌體表面展示技術(shù)核糖體分型（ribotyping）脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）多位點序列分型（MLST）基于PCR的分型技術(shù)分子診斷一：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)DrMullis(1993年諾貝爾化學(xué)獎）。

94℃變性50-65℃退火XX℃延伸基本原理模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反應(yīng)緩沖液輔助因子：Mg2+PCR反應(yīng)體系TaqP1P2dATPdTTPdGTPdCTPMg2+PCR反應(yīng)成分和其對反應(yīng)的影響APCR反應(yīng)的緩沖液

是重要影響因素，特別是其中的Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。一般為1.5-2.0mmol/LMg2+是比較合適的。B底物

濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，過低導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降。4種dNTP在使用時必須以等量濃度配制。C酶（TaqDNA聚合酶）

其濃度過高，可引起非特異性產(chǎn)物的擴增，過低則合成產(chǎn)物量減少。一般100uL反應(yīng)體系中酶的用量為0.5-5U。D引物

為最關(guān)鍵的因素。濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，且增加引物二聚體的機率。濃度一般為0.1-0.5umol/L。E.模板DNA

DNA模板一般100ng/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性2）特異性引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。3）操作簡便易行只需要數(shù)小時,就可以擴增出DNA。引物設(shè)計原則（1）序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列；（2）引物長度以15-40bp為宜；（3）堿基盡可能隨機分布，G+C占40-60%；（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)；（5）兩引物間避免有互補序列；（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。常用PCR反應(yīng)類型常規(guī)PCR多重PCR套式PCRReal-timePCRM12341000bp500bp250bp1500bp459bp688bp532bp750bp豬鏈球菌2型PCR擴增產(chǎn)物電泳圖定性PCR定量PCR臺州Vp雙重PCR鑒定電泳圖實時定量PCR常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。擴增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件實時熒光定量PCR原理---------擴增曲線DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

SYBRGreen法工作機理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreenSYBRGreen法熔解曲線分析熔解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確熔解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物SYBRGreen法-PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同SYBRGreen法優(yōu)缺點對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高缺點方法2-TaqMan法5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等；

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)；探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光；

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針；TaqMan法工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光TaqMan法PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號/背景比值的最大值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同TaqMan法優(yōu)缺點對目標(biāo)序列的高特異性

------陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單

------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補重復(fù)性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點分子診斷二：核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交的基礎(chǔ)：分子單鏈之間的互補堿基通過非共價鍵（主要是氫鍵）的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。核酸探針的種類根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類；DNA探針DNA探針指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列。這些DNA片段須是特異的。探針制備建立細(xì)菌基因組DNA文庫，獲得細(xì)菌特異的核酸探針。建DNA表達(dá)文庫，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個陽性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段DNA探針的優(yōu)點這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記

固相膜核酸分子雜交方法DNA的分離、變性變性DNA轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜洗膜、干燥、固定預(yù)雜交液浸泡加入探針雜交洗膜結(jié)果顯示SouthernBlot操作流程DNA芯片在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá)的信息)。由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片技術(shù)的優(yōu)勢①基因診斷的速度顯著加快，一般可于30min內(nèi)完成。若采用控制電場的方式，雜交時間可縮至1min甚至數(shù)秒鐘②檢測效率高，每次可同時檢測成百上千個基因序列，使檢測過程平行化。③基因診斷的成本降低。④芯片的自動化程度顯著提高，通過顯微加工技術(shù)，將核酸樣品的分離、擴增、標(biāo)記及雜交檢測等過程顯微安排在同一塊芯片內(nèi)部，構(gòu)建成縮微芯片實驗室。⑤因為是全封閉，避免了交叉感染；且通過控制分子雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度，使基因診斷的假陽性率、假陰性率顯著降低。

分子診斷三：噬菌體展示技術(shù)以改造的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)區(qū)，使外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)并展示于噬菌體表面，進(jìn)而通過親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，最終獲得具有特異結(jié)合性質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)，并實現(xiàn)基因克隆化的一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)。噬菌粒的構(gòu)建分型技術(shù)傳統(tǒng)表型分析法

傳統(tǒng)的分型技術(shù)主要根據(jù)病原菌的外在生理、生化特性等表型進(jìn)行分型的，主要有血清分型、噬菌體分型、多區(qū)帶酶電泳分型、酯酶分型等。盡管傳統(tǒng)的分型技術(shù)應(yīng)用比較廣泛，但區(qū)分度低、重復(fù)性差、標(biāo)準(zhǔn)型難仍是其制約因素。

分子(或DNA)分型法相對于傳統(tǒng)的分型方法，分子分型具有高分辨率、可重復(fù)性，易于標(biāo)準(zhǔn)化及自動化，主要有一下方法：脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）多位點序列分型（MLST)核糖體分型（Ribotyping）基于PCR的分型技術(shù)

分子分型一：脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）PFGE通過選擇特定的限制性內(nèi)切酶，將細(xì)菌DNA切成8-25條大小為40-600kb的條帶，然后通過不斷變換電流方向，使各條帶得到較好的分離。細(xì)菌的染色體稀有酶切位點限制性內(nèi)切酶消化電泳PFGE分型重復(fù)性好，分辨率強，目前分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”；方法在技術(shù)上較復(fù)雜，需要特殊的儀器以及操作時需要較長的時間，約需2-3天。分子分型二：多位點序列分型（MLST）對多個基因或基因片段進(jìn)行測序來確定細(xì)菌的亞型及各分離株之間遺傳相關(guān)性的分型方法。與PFGE及核糖體分型相比，MLST結(jié)果明確而且便于解釋。

MLST分型方法實驗流程病原菌檢測鑒定

增菌培養(yǎng)基因測序序列分析可靠序列數(shù)據(jù)分析

結(jié)果結(jié)論看家基因擴增分子分型三：核糖體分型Theprincipleofribotyping核糖體分型是利用Southern印跡分析來檢測與核糖操縱子有關(guān)的多態(tài)性。DNA由限制性內(nèi)切酶消化，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分開的限制性片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，加上標(biāo)記探針，這樣即可檢出含細(xì)菌rRNA基因的限制性片段。

分子分型四：基于PCR的分型技術(shù)隨機擴增DNA多態(tài)性分析分型（RAPD）PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析分型（PCR-RFLP）擴增片段長度多態(tài)性分析分型（AFLP）重復(fù)片段PCR分型（REP-PCR）MLMLNLVLWLSLGLGLM3PCR方法鑒定不同種李斯特菌iaplmo0036lmo0041PCR擴增條件94℃3min94℃30s55℃30s72℃1min72℃10min