細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞化學(xué)染色檢驗

申家輝1

一、概述二、細(xì)胞化學(xué)染色的基本方法三、臨床應(yīng)用

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1、概念：

細(xì)胞化學(xué)染色是細(xì)胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合而成的一門科學(xué)，以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運用化學(xué)反應(yīng)的原理對血細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)（包括酶類、脂類、蛋白質(zhì)、糖類、鐵、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。3一、概述

2.細(xì)胞化學(xué)染色的目的

（1）輔助判斷急性白血病的類型（2）輔助血液系統(tǒng)等疾病的診斷與鑒別診斷

3.細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟：包括固定、顯色反應(yīng)、復(fù)染。（1）固定：為了保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的穩(wěn)定性而選用的方法。根據(jù)染色的目的，最常用的固定劑有甲醛、甲醇、乙醇等。

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（2）顯色：通過不同的化學(xué)反應(yīng)，最終形成穩(wěn)定的有色沉淀，使被監(jiān)測的化學(xué)物質(zhì)顯示出來。包括偶氮偶聯(lián)法：如NAP、ACP及各種脂酶染色普魯氏藍(lán)反應(yīng)：如鐵染色雪夫（shiff）反應(yīng)：如PAS染色聯(lián)苯胺法：如POX染色

（3）復(fù)染：使各種目的細(xì)胞能顯示出來更便于觀察

6過氧化物酶染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色糖原染色非特異性酯酶染色特異性酯酶染色骨髓鐵染色7二、細(xì)胞化學(xué)染色的基本方法

1、原理：poxH2O2

O

聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺藍(lán)+

亞硝基鐵氰化鈉8藍(lán)黑色顆粒（一)過氧化物酶(POX)染色

2.試劑

(1)聯(lián)苯胺酒精溶液：取0.3g聯(lián)苯胺加亞硝基鐵氰化鈉飽合液（36%）1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。

(2)稀過氧化氫（新鮮配制）：取50ml蒸餾水加30%H2O21滴。（3）瑞吉氏復(fù)染液

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3、染色方法

1、新鮮干燥涂片加聯(lián)苯胺酒精溶液10滴，覆蓋整個髓膜，固定1-2min。2、再加等量的稀H2O2，混勻后染色4－5min,勿倒去染液直接流水沖洗。3、瑞氏染液復(fù)染。10

4、注意事項

（1）H2O2要新鮮配制，注意有效性（2）標(biāo)本要新鮮，最長不超過一周，時間長了酶活性減弱。（3）POX染色后，一定要沖洗干凈，否則染料堆積或浮于表面，影響瑞氏染色結(jié)果觀察。11

5、結(jié)果判定：中性粒細(xì)胞桿狀及分葉核呈強(qiáng)陽性是染色成功的標(biāo)志(設(shè)對照片）。在細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)藍(lán)綠色或藍(lán)棕色顆粒為陽性反應(yīng)。121.中性成熟粒細(xì)胞，呈強(qiáng)陽性；2.晚幼紅細(xì)胞，呈陰性；3.單核細(xì)胞，呈弱陽性；4.漿細(xì)胞，呈陰性14急性粒細(xì)胞白血?。∕2a)的POX染色原始粒細(xì)胞均呈陽性

急性淋巴細(xì)胞白血病的POX染色1.中性成熟粒細(xì)胞，呈強(qiáng)陽性；其他原始淋巴細(xì)胞均呈陰性

急性早幼粒細(xì)胞白血病的POX染色１.原始紅細(xì)胞，呈陰性；其他早幼粒細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性

急性單核細(xì)胞白血病的POX染色1.中性成熟粒細(xì)胞，呈強(qiáng)陽性；2.原始單核細(xì)胞，呈陽性；3.原始單核細(xì)胞，呈弱陽性；其他原幼單核細(xì)胞呈陰性

6、臨床意義

（1）正常分布

粒系:早期原粒陰性，晚期原粒及以下各階段呈不同程度陽性。

單核系:早期原單陰性，其它階段皆呈弱陽性。

淋巴、紅系、漿細(xì)胞、巨核均呈陰性。19

（2）急性白血病的鑒別診斷

幼稚細(xì)胞POX陽性率≥3%：急非淋（AML)

幼稚細(xì)胞POX陽性率＜3%：急淋（ALL)

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（二）中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色

（偶氮偶聯(lián)法）1.原理磷酸奈酚鈉磷酸+萘酚

偶聯(lián)萘酚+重氮鹽不溶性有色沉淀物定位于胞漿(堅固藍(lán)RR鹽)

21NAPPH9.2～9.8222.試劑（1）固定劑：10％甲醛甲醇溶液（2）Tris-Hcl緩沖液的配制：Tris粉〔三胺基甲烷〕4.85克溶于200ml蒸餾水中,加濃HCL1-2滴，PH調(diào)至9.2，4℃保存?。?）作用(基質(zhì)液):磷酸萘酚鈉5mg

N-N二甲基酰胺1ml

Tris-Hcl液4ml

堅固藍(lán)RR鹽5mg

（4）復(fù)染液：1%中性紅

3.操作步驟

1、新鮮、干燥的外周血或骨髓涂片（標(biāo)本片及對照片）加固定劑作用30秒（染缸），水洗待干；2、滴加作用液，室溫染色15min，水洗待干；3、1%中性紅復(fù)染1min234.注意事項

(1)重氮鹽以堅固藍(lán)RR鹽為最佳；(2)堅固藍(lán)RR鹽應(yīng)適量：過多易造成染色失敗，過少使反應(yīng)減弱；(3)每次都要做陽性對照；(4)作用液新鮮配制，配好后要立即使用24

5.結(jié)果觀察:(對照片成熟中性粒細(xì)胞中出現(xiàn)棕黑色顆粒為陽性細(xì)胞，說明染色成功)正常人除成熟中性粒細(xì)胞NAP可見陽性外，其它血細(xì)胞均為陰性。且正常陽性率＜40%，積分值30～130分。

256.NAP陽性結(jié)果及積分判斷標(biāo)準(zhǔn)“－”0分，胞漿中無陽性顆?！?”1分，胞漿中含有少量顆?！?+”2分，胞漿中含有中等量顆?！?+”3分，胞漿中含有豐富的顆粒，但胞核清楚“4+”4分，胞漿中含有豐富粗大的顆粒，但胞核不清楚中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色1.中性成熟粒細(xì)胞（+）；2.中性成熟粒細(xì)胞（++）；3.中性成熟粒細(xì)胞（+++）；4.中性成熟粒細(xì)胞（++++）；5.淋巴細(xì)胞（-）2829NAP分級

7.臨床意義

增高：細(xì)菌感染、類白、AA、急淋、慢粒急變、骨髓增殖性疾病，惡性淋巴瘤。

降低：慢粒、急粒、PNH、MDS、惡組30

8.鑒別診斷

慢粒與類白：前↓；后↑。PNH與AA：前↓；后↑。

急粒與急淋：前↓；后↑。MDS與慢性再障：前↓；后↑。病毒感染與細(xì)菌感染：前者無明顯變化，后者↑。惡組與反應(yīng)性組織細(xì)胞增多：前↓；后↑。

31（三）酯酶染色概述特異性酯酶染色非特異性酯酶染色

概述

根據(jù)各類細(xì)胞所含酯酶特異性高低分為特異性酯酶(SE)和非特異性酯酶(NSE)；特異性酯酶是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特異性酯酶根據(jù)水解基質(zhì)液的PH不同，又分為中性NSE（α-醋酸萘酚酯酶

），酸性NSE（酸性α-醋酸萘酚酯酶），堿性NSE（α-丁酸萘酚酯酶）。目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE和α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）+NaF抑制試驗。1.原理（偶氮偶聯(lián)法）氯乙酸AS－D萘酚AS－D萘酚

+重氮鹽(堅固藍(lán)B鹽)34NAS-DCE不溶性有色沉淀物定位于胞漿內(nèi)酶所在位特異性酯酶(CE)染色基質(zhì)液基質(zhì)液

2.試劑：

（1）固定液：10％甲醛甲醇溶液（2）作用液（基質(zhì)液）氯乙酸AS－D萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸鹽緩沖液19ml

堅固藍(lán)B鹽10mg（3）復(fù)染液：1%中性紅

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3.染色方法（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37℃孵育30min，水洗（3）1%中性紅復(fù)染1min，水洗晾干鏡檢。36

4.注意事項：

1.氯乙酸AS-D萘酚溶液應(yīng)避光，4℃冰箱保存，變黃或混濁即失效。

2.染色溫度37℃效果最好375.結(jié)果判斷

中性分葉核粒細(xì)胞胞漿中見細(xì)小，彌漫分布的藍(lán)色顆粒為染色成功的標(biāo)志。6.臨床意義

粒系除早期原粒外，其余階段細(xì)胞均為陽性，其它各系均為陰性。CE染色對粒細(xì)胞白血病有特異性的診斷價值。3839CE

非特異性酯酶染色（α-NAE）1.原理：α-醋酸萘酚α-萘酚重氮鹽40α-NAE形成不溶性有色沉淀定位于胞漿內(nèi)酶所在位置7.4~7.6(堅固鹽B)

2.試劑（1）固定液：甲醛（2）作用液:

α-醋酸萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸鹽緩沖液10ml固藍(lán)B鹽10mg

（3）復(fù)染液：10g/L甲基綠水溶液41423.染色步驟（1）甲醛蒸氣固定5-10min，流水沖洗5min晾干（2）放入作用液37℃1h,流水沖洗。（3）10g/L的甲基綠溶液復(fù)染5min,水洗待干鏡檢

（4）NaF抑制試驗：在40ml作用液中加NaF15mg同樣染色后，油鏡計數(shù)100個被檢細(xì)胞，分別計算出抑制前和抑制后的陽性率和積分，按公式計算出抑制率，正常小于50%。

A圖：急性單核細(xì)胞白血病α-NAE染色

原始、幼稚單核細(xì)胞多呈強(qiáng)陽性

B圖：急性單核細(xì)胞白血病

α-NAE氟化鈉抑制染色原始、幼稚單核細(xì)胞陽性反應(yīng)被氟化鈉抑制（與A圖為同一標(biāo)本）

A

B

4.結(jié)果判斷：胞漿內(nèi)有棕色或棕黑色沉淀物為陽性

染色成功指標(biāo)：正常部分原始、幼稚及成熟單核細(xì)胞呈陽性；部分粒細(xì)胞為弱陽性反應(yīng)；部分成熟淋巴或個別中、晚幼紅呈陽性。

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5.臨床意義：鑒別急性白血病

（1）急單時，原始至成熟單核大多為α-NAE陽性，且易被NaF抑制，抑制率正常大于50%。

（2）急粒時，白血病細(xì)胞多呈陰性或弱陽性，M3呈陽性，但均不被NaF抑制。

酯酶雙染：同一張血涂片上的細(xì)胞分別在兩種不同的基質(zhì)液中作用一定時間，復(fù)染鏡檢。主用于鑒別診斷AML-M4亞型。

46骨髓涂片特異性酯酶（CE）和非特異性酯酶（NAE）的雙酯酶染色顯示，原始粒細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色CE陽性反應(yīng)；而原始單核細(xì)胞胞漿呈棕色的NAE陽性反應(yīng)。（四）糖原染色(PAS)細(xì)胞內(nèi)糖原中的乙二醇基48氧化過碘酸二醛基

1.原理（過碘酸-雪夫氏反應(yīng)）二醛基經(jīng)過加成和縮合使無色亞硫酸品紅恢復(fù)品紅的紅色失去亞硫酸定位于含有糖原的細(xì)胞內(nèi)2.試劑

（1）10g/L的過碘酸氧化劑⑵雪夫氏試劑（schiff）：紅色品紅與偏重亞硫酸鈉，變成了無色品紅。

⑶20/L甲基綠復(fù)染液493.操作

（1）新鮮髓片放在95％乙醇中固定10分鐘；蒸餾水沖洗待干；（2）10g/L過碘酸氧化15分鐘；蒸餾水沖洗；（3）置雪夫氏試劑浸泡45分鐘，水洗后涼干；（4）甲基綠復(fù)染15分鐘，水洗待干鏡檢。

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4.注意事項

（1）所用染色缸及器具應(yīng)十分清潔、干燥。（2）雪夫氏染液應(yīng)避光密封保存，變紅則失效。（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸餾水洗涂片，而且一定要完全干燥，若有水，試劑變色失效。51

（4）染色時間和溫度應(yīng)相對恒定，一般37℃效果最好。（5）染好的標(biāo)本不能久放，8天后漸退色，因此應(yīng)及時觀察。52

5.結(jié)果觀察

陽性：細(xì)胞漿內(nèi)的紅色陽性物呈彌散狀、顆粒狀或塊狀，胞核染綠色。陰性：胞漿無色或無紅色顆粒。

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6.臨床意義

正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)（1）粒系：原始細(xì)胞多為陰性，隨著細(xì)胞成熟，陽性逐漸增強(qiáng)。（2）淋系：正常人陽性率10-50%之間，多為20%以下。（3）紅系：PAS呈陰性反應(yīng)（4）巨核：PAS呈陽性反應(yīng)（5）單核系:呈陰性或細(xì)顆粒狀弱陽性。54正常血細(xì)胞PAS染色1.原始粒細(xì)胞（-）2.早幼粒細(xì)胞（+）3.中性中幼粒細(xì)胞（++）4.中性晚幼粒細(xì)胞（+++）5.中性桿狀核粒細(xì)胞（++++）6.中性分葉核粒細(xì)胞（++++）

7.嗜堿性粒細(xì)胞（+++）8.嗜酸性粒細(xì)胞（+++）9.單核細(xì)胞（±）

10.淋巴細(xì)胞（++++）

疾病鑒別

（1）紅細(xì)胞系統(tǒng)疾?。篗6、MDS呈