蛋白質(zhì)芯片的綜述

蛋白質(zhì)芯片的綜述摘要蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，已在多個領域得到應用，如蛋白質(zhì)組學研究、新藥的開發(fā)、酶與底物的相互作用和疾病檢測等。論文詳細介紹了蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的原理、芯片介質(zhì)及蛋白質(zhì)的固定技術(shù)，論述了蛋白質(zhì)芯片在腫瘤研究，食品檢驗的應用以及傳染病檢測中的研究概況。分析了蛋白質(zhì)芯片的問題以及應用前景。關鍵詞蛋白質(zhì)芯片，腫瘤，食品檢驗，傳染病檢測，應用蛋白質(zhì)芯片的研究工作起始于20世紀80年代，到90年代技術(shù)日趨成熟。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)技術(shù)因具有高通量平行分析、信噪比較高、所需樣品量少，以及可直接關聯(lián)DNA序列和蛋白質(zhì)信息等優(yōu)點，自問世以來，已廣泛應用于蛋白質(zhì)組學、醫(yī)學診斷學等領域研究，具有廣闊的發(fā)展。蛋白質(zhì)芯片介紹1.1技術(shù)原理蛋白質(zhì)芯片是由固定于不同介質(zhì)上的蛋白微陣列組成，這些蛋白包括抗原、抗體及標志蛋白,然后用標記的或未經(jīng)標記的另外一個蛋白，如抗原、抗體或配體進行反應，有的需要經(jīng)洗滌后再加入標記的二抗進行反應，從而達到放大抗原抗體反應的目的。所用的標記物有熒光物質(zhì)，如Cy3(青色素，一種熒光染料)和Cy5等;酶，如辣根過氧化物酶，化學發(fā)光物質(zhì)等;其他分子，如免疫金標記，然后再進行銀染對反應結(jié)果顯色。反應結(jié)果用掃描裝置進行檢測或用肉眼直接進行觀察。1.2蛋白質(zhì)芯片的介質(zhì)目前作為蛋白芯片的介質(zhì)有濾膜類、凝膠類和玻璃片類，前2種介質(zhì)的優(yōu)點是能夠保持所固定的蛋白的三維結(jié)構(gòu)，但缺點是由于其質(zhì)地較軟，所以不能滿足機械點樣的強度，同時凝膠類的蛋白質(zhì)芯片所點樣品容易發(fā)生擴散。玻璃片的優(yōu)點是成本低和性能穩(wěn)定，可滿足高強度的機械點樣。此外,20世紀90年代中期發(fā)展的液相芯片技術(shù)使蛋白芯片技術(shù)得到進一步提高。其被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)，也可稱為靈活的多種被分析物質(zhì)的檢測(flexiblemulti-analyteprofiling,xMAP)技術(shù),xMAP技術(shù)是集流式技術(shù)、熒光微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學技術(shù)為一體的一種新型生物分子高通量檢測技術(shù)，這種技術(shù)將流式檢測與芯片技術(shù)有機地結(jié)合在一起，使生物芯片反應體系由固相反應改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應體系，因此也被稱為液相芯片技術(shù)［1］。光學蛋白芯片也是新發(fā)展起來的一項技術(shù)，是將高分辨的橢偏生物傳感器技術(shù)和集成化多元蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合發(fā)展形成的生物分子識別和檢測技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點是無需標記待檢樣品,無需預處理直接檢測非純化分析物，樣品用量少，檢測時間短并且可以進行多元檢測。1.3蛋白質(zhì)的固定將蛋白質(zhì)固定于芯片上的方法很多，各方法的最終目的是在單位面積/體積上固定最大量的蛋白質(zhì)并保持其天然構(gòu)象，該環(huán)節(jié)成為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的關鍵步驟之一。蛋白質(zhì)的固定可以分為兩類:非專一性固定和專一性固定,非專一性固定即通過被動吸附的方式使蛋白質(zhì)結(jié)合到相應的介質(zhì)上，如硝酸纖維素膜和多聚賴氨酸包被的玻片通過被動吸附蛋白質(zhì)的氨基或羧基來固定蛋白質(zhì)，此方法產(chǎn)生的芯片背景值往往較高。1.4蛋白質(zhì)芯片的檢測蛋白質(zhì)芯片的檢測包括兩類方式，一類是直接檢測法，即直接對捕捉到的蛋白進行檢測，包括加強納米簇共振技術(shù)、等離子體共振技術(shù)(SPR)、固相激光激發(fā)時間分辨熒光光譜法和表面加強激光解吸離子-飛行時間質(zhì)譜法(SELDI-TOF-MS)。另一類檢測方法是間接檢測法，即通過使用發(fā)光物質(zhì)包括熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、酶、同位素等對被檢測物或其抗體進行標記，然后用激光掃描或CCD對信號進行檢測。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)用2.1蛋白質(zhì)芯片在腫瘤研究中的應用2-11蛋白質(zhì)表達譜的檢測蛋白質(zhì)芯片可以檢測兩種不同樣品(患病組與健康組，藥物治療前與治療后)之間蛋白質(zhì)表達水平的相對差異。根據(jù)蛋白表達差異推測參與疾病發(fā)生發(fā)展相關蛋白，還可以根據(jù)治療前后蛋白表達不同判斷患者對藥物治療的敏感性。在研究血管生成因子與腫瘤的關系時,Huang等［2］利用蛋白質(zhì)芯片檢測143例各類型腫瘤患者5種血管生成因子的表達水平。發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤病人均有某種血管生成因子升高,而且不同腫瘤類型血管生成因子升高也不同。血管生成在腫瘤生長和擴散中起重要作用，因此血管生成因子所反應的腫瘤血管生成的活躍程度對組織病理分級，治療方案的選擇具有重要的指導意義。LauraSmith等［3］利用抗體芯片分析MDA-MB-231乳腺癌細胞系及其衍生系對阿霉素的抵抗性。抵抗組與敏感組相比絲裂原活化蛋白磷酸化激酶，周期蛋白D2,細胞角蛋白18,細胞周期素B1等明顯下降。根據(jù)藥物治療前、后表達的不同蛋白，可以預測患者對藥物治療的敏感性并給予個體化治療，使患者能在最大程度上受益。2.12蛋磷酸化檢測蛋白質(zhì)芯片還可以用來研究蛋白質(zhì)的磷酸化水平改變。原理與普通抗體芯片相同，區(qū)別在于加入的抗體是熒光染料(如Cy3、Cy5等)標記的磷酸化酪氨酸(或是絲氨酸、蘇氨酸)抗體。KNMendes等［4］用特異性抗體芯片檢測了52種不同信號蛋白的磷酸化水平并進行分析。發(fā)現(xiàn)幾種不同類型腫瘤均有PI3-K表達上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)各腫瘤類型有其特異的信號通路變化，比如，胰腺癌中表皮生長因子介導的信號通路中，p16ink和Rb成逆相關。Boyd等利用反相蛋白質(zhì)芯片檢測30個乳腺癌細胞系100種蛋白質(zhì)的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶相關激酶的抑制劑使Akt信號通路中的磷脂酰肌醇(-3)激酶補償性上調(diào)。由于蛋白質(zhì)的磷酸化在生物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程中起相當重要和廣泛的作用，因此對于蛋白質(zhì)磷酸化檢測具有重要的生物學意義。2?13腫瘤標志物聯(lián)合診斷蛋白質(zhì)芯片具有同時并行測多個假定標志物的特點，因此可以更完整的描述癌癥患者血清的變化。RandalOrchekowski等利用抗體芯片來檢測與胰腺癌有關的血清蛋白，并利用聯(lián)合診斷的方法對樣品進行分級。與良性病變和健康者相比，胰腺癌患者Anti-PIVKA-II,Anti-CA15-3,Anti-IgA,Anti?cathepsinD升高而Anti?serumamyloidA降低。一般認為Anti-PIVKA-II升高與肝癌和維生素K利用障礙有關，而胰腺癌引起的膽道梗阻可以導致維生素K利用障礙;Anti-IgA升高可能與胰液分泌增多和漏出有關;組織蛋白D則與癌細胞的侵襲行為有關。將這些與腫瘤相關的標志物聯(lián)合起來可以顯著提高診斷的準確率。很多用于診斷的特異腫瘤標志物還沒有發(fā)現(xiàn)，因此單個指標將被多指標聯(lián)合診斷所取代。有研究表明，卵巢癌單個腫瘤標志物CA125已經(jīng)被IL-18,FGF-2和CA125聯(lián)合診斷所取代。胞漿絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，T型盒轉(zhuǎn)錄因子3和抗肌萎縮蛋白utrophin被用作檢測乳腺癌和卵巢癌的標志物。聯(lián)合這些互補又不重合的標志物,可以顯著提高診斷的準確率，與單個腫瘤標志物相比具有明顯優(yōu)勢。2.2蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在食品檢驗的應用2.21食品中殘留農(nóng)藥、獸藥和抗生素的分析目前農(nóng)藥、獸藥和抗生素在食品生產(chǎn)和加工過程中廣泛使用。各類禽肉中普遍檢出各類獸藥和抗生素的殘留，主要包括有鹽酸克倫特羅（瘦肉精）、青霉素、氯霉素和磺胺二甲嘧啶等。蔬菜和水果的生產(chǎn)加工中也普遍存在著農(nóng)藥殘留的狀況。目前用于農(nóng)藥、獸藥和抗生素殘留檢測的方法主要有生物化學技術(shù)、氣相色譜法和高效液相色譜法和ELISA等。生物化學方法作為傳統(tǒng)方法一直起到巨大的作用，但由于現(xiàn)在食品生產(chǎn)加工技術(shù)和生物技術(shù)的飛躍發(fā)展，該技術(shù)暴露出了明顯的過程復雜、速度慢和精確度低的缺點；氣相色譜法和高效液相色譜法靈敏度較高，但存在前處理過程復雜、速度慢、儀器化程度高等不足；微生物法簡便，但靈敏度和特異性低；ELISA特異性高，檢測限低，但檢測組分單一，不適合多組分同時檢測。而基于競爭免疫反應原理的蛋白質(zhì)芯片測定方法相對于以上各種方法具有高通量、并行性、多組分同時測定、靈敏度高、特異性強等諸多優(yōu)點。北京博奧生物芯片公司已開發(fā)基于免疫原理的蛋白質(zhì)芯片和配套的樣品制備掃描和檢測裝置,可用于重點獸藥殘留的檢測［5］。軍事醫(yī)學科學院已成功地制作了檢測農(nóng)藥阿特拉津半抗原的蛋白質(zhì)芯片和檢測罌粟堿的蛋白質(zhì)芯片，最低檢測限分別為0.001g/mL和0.01以g/mL［6］。左鵬采用蛋白芯片的方法檢測食品中的氯霉素和磺胺二甲嘧啶殘留，充分體現(xiàn)出了該方法快速、高通量、并行性等特點［7］。2.22食品中污染病原菌和生物毒素的檢測食品衛(wèi)生檢驗中微生物和生物毒素的檢測一直都是重點。由于不同食品中致病微生物的種類繁多且復雜，帶來了檢測的困難，用單一的生物化學方法或ELISA檢測都有著檢測種類單一、處理復雜的缺點，特別是在遇到突發(fā)的罕見微生物污染時，傳統(tǒng)的檢測方法這些缺點體現(xiàn)的很明顯。而蛋白芯片以其高精度、高通量、快速的特點幾乎可以在很短的時間內(nèi)將常見的的微生物都檢測出來.生物毒素和致病微生物蛋白芯片是利用抗原/抗體的特異性反應原理進行檢測的。該類蛋白質(zhì)芯片所固定的配基是單克隆抗體，因此，制備芯片的原料就是可以是所有可能的致病菌（甚至包括其不同種、菌株）所分泌的特定毒素或其保守基因表的蛋白。用事先實驗設計、驗證好的單克隆抗體按一定規(guī)律點印在芯片上制作蛋白質(zhì)芯片，就可以制成需要的蛋白質(zhì)芯片。需要說明的一點是，利用蛋白芯片進行檢測時，樣品也可以是未經(jīng)提純的樣品液，但由于樣品中存在的其它物質(zhì)的影響，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此在對樣品進行適當必要的提取、純化等預處理是必要的。2.23轉(zhuǎn)基因食品的檢測蛋白質(zhì)芯片通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有高通量、微型化、自動化和信息化的特點，是轉(zhuǎn)基因食品檢測的方向。轉(zhuǎn)基因食品蛋白質(zhì)芯片可以將待檢的蛋白質(zhì)固定于玻片上制成檢測芯片，可以對一個基因的信號通路上下游蛋白同時進行分析,為研究新的蛋白對人體免疫系統(tǒng)影響機理提供完整的技術(shù)資料。通過分析確定該類轉(zhuǎn)基因食品對人體的危害。非常適合于轉(zhuǎn)基因作物及加工品檢測，使之具有廣闊發(fā)展前景。2.3蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在傳染病檢測中的應用相比細菌引起的傳染病而言，病毒性傳染病具有更大的威脅。由于病毒病沒有特效藥進行治療，因此，病毒性傳染病的早期確診對于人或動物的及時治療及相應措施的實施至關重要。2.31對SARS的檢測SARS，即嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征，是由冠狀病毒引起的一種人類傳染病，曾在2003年給世界造成很大的經(jīng)濟損失。ZhuH等［8］用酵母表達系統(tǒng)表達SARS病毒的全基因組,用表達產(chǎn)物制作蛋白芯片進行SARS的診斷，發(fā)現(xiàn)所表達的SARS病毒的N蛋白的C末端及N蛋白的全長作為診斷抗原時，有很高的反應性，該片段富含一段短的賴氨酸序列，是SARSV所獨有的,顯示出很高的抗原反應性。通過比較發(fā)現(xiàn)，其敏感性與ELISA相當,但特異性要比ELISA高。通過將血清樣本重復3次，其重復性能達到98%。特異性與間接熒光相比稍差，可能與血清樣品的稀釋度有關，間接熒光方法的血清稀釋度是1：10，而蛋白芯片的為1：200,顯示出蛋白芯片中的血清用量更少。2.32對禽流感的檢測禽流感不僅是禽類養(yǎng)殖中的重大威脅，而且已成為人類健康的一個重大隱患，目前東南亞國家死于禽流感的人數(shù)在不斷增加，我國也有禽流感病毒感染死亡的病例。石霖等［9］制備了可以同時鑒別診斷禽流感(AI)、新城疫(ND)2種禽病血清抗體的可視化蛋白芯片?？乖瓉碜杂诔匐x心法和蔗糖密度梯度法純化的2種病毒蛋白抗原，芯片與待檢血清雜交后，再與膠體金標記的二抗雜交,銀染顯色后根據(jù)灰度值來判斷結(jié)果。結(jié)果顯示其芯片無交叉反應，而且呈現(xiàn)較強的雜交信號。與瓊擴(AGP)抗體檢測方法相比,檢測靈敏度是AGP方法的400倍以上。同時他的另外一個研究可以同時檢測4種禽類疾病，大大提高了工作效率［10］。2.33對乙肝病毒的檢測乙肝病毒的檢測應用ELISA檢測時間長，操作復雜,需要分別對幾種抗體和抗原進行檢測。將幾種方法合并將會使該病毒的檢測時間縮短，大大提高工作效率。董亞芳等［11］通過研究實現(xiàn)了此功能，其采用PVDF膜制備不同的蛋白質(zhì)芯片，以辣根過氧化物酶標記抗體，結(jié)合酶聯(lián)免疫反應，檢測乙肝病毒素面抗原(HBsAg)、表面抗體(HBsAb),乙肝病毒e抗原(HBeAg)、e抗體(HBeAb)。結(jié)果顯示,所制備的蛋白質(zhì)芯片可檢測到微量乙肝病毒抗原、抗體的存在，其中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb的最低可檢測濃度分別為11、4.8、2.1、18以g/mL,而且兩種抗原或兩種體間并無交叉反應。此法制備芯片需3.5h,而檢測過程僅需20min,且結(jié)果直接可用肉眼觀察。蛋白質(zhì)芯片的問題與展望蛋白質(zhì)芯片技術(shù)最近幾年的發(fā)展極為迅速，已被證明是整個基因組研究和大規(guī)模發(fā)現(xiàn)研究的有力工具，越來越多的應用實例證明了蛋白質(zhì)芯片的廣闊應用前景及其市場價值。但目前的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)也存在一些問題：(1)目前大多數(shù)來于cDNA文庫的克隆體系不能通過正確地閱讀框架編碼蛋白質(zhì);或者不能正確表達產(chǎn)生具有氨基酸全序列的蛋白質(zhì);或者缺少活性必需的翻譯后修飾;或者通過細菌表達的蛋白質(zhì)不能形成正常的空間構(gòu)象,這些都將直接影響有關蛋白質(zhì)功能的研究。(2)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)本身面臨著亟待解決的問題,包括:什么樣的片基表面化學分子可以高親和性、高特異性、高選擇性地固定陣列分子;蛋白質(zhì)在點樣過程中如何保持活性;如何選擇適當?shù)臒晒鈽擞洺潭纫员苊饨档偷鞍踪|(zhì)活性或者造成信號的遺失;如何優(yōu)化固定陣列分子的條件;如何選擇最適的芯片保存條件等。(3)目前蛋白質(zhì)芯片在靈敏度、特異性，可重復性方面還無法完全達到一些實驗的要求。(4)由于生物細胞中蛋白質(zhì)的多樣性和功能的復雜性，目前的蛋白質(zhì)芯片在多樣品并行處理能力，攝取蛋白質(zhì)的數(shù)目和種類，數(shù)據(jù)處理和資料分析的軟硬件設備方面還有待進一步提高。(5)蛋白質(zhì)芯片還不能完全做到試驗樣品微量化，使得一些研究由于樣品來源不足(如從少量組織樣本中尋找腫瘤標記)而受限。(6)目前的檢測方法或者標記困難，檢測靈敏度低，或者需要昂貴的檢測儀器和苛刻的實驗條件。這些問題不僅在某些程度上限制了蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展，還會直接影響該技術(shù)臨床應用的進程。目前，各芯片技術(shù)開發(fā)商針對上述問題加強相關技術(shù)研發(fā)，創(chuàng)立了早期檢測研究網(wǎng)絡(earlydetec-tionresearchnetwork,EDRN),美國國家癌癥研究所在生物標記物研究中發(fā)揮了領導作用。這一網(wǎng)絡將學術(shù)界和生產(chǎn)部門的專家聯(lián)合起來，以加速生物標記物的研究和論證。它為蛋白質(zhì)組學加快已發(fā)現(xiàn)的蛋白標記物轉(zhuǎn)化為臨床早期診斷工具和風險評估提供了公共平臺。我們有理由相信,不斷改進的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)將逐步實現(xiàn)它對蛋白質(zhì)組學、醫(yī)學研究、藥物開發(fā)和臨床診斷等的巨大推動作用，而各種不同途徑的數(shù)據(jù)整合也必將會不斷加深我們對生命的理解。參考文獻:楊洋，湯華.液相芯片技術(shù)在檢驗醫(yī)學和生物醫(yī)學中的應用[J].中國生物化學與分子生物學報，2007,23(4):256-261.RuochunHuang,YingLin,LisFlowers,etal.Molecularprofilingofgiogenicfactorsfromgynecologicalcancerpatients’plasmausinginnovativeproteinrraytechnology[J].AACRMeetingAbstracts,2004.LauraSmith,MarkB.Watson,SaraL.O’Kane,etal.Theanalysisofoxorubicinresistanceinhumanbreastcancerce