蛋白質(zhì)變復(fù)性

變復(fù)性的過程E.coli中表達(dá)的蛋白常常以包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物。生產(chǎn)研究中為了得到較高的目的蛋白的表達(dá)量，通常會(huì)采用較強(qiáng)的啟動(dòng)子（如久PL、T7或串聯(lián)啟動(dòng)子），使外源基因可在胞內(nèi)獲得高效表達(dá),一般占細(xì)菌總蛋白的10%?50%.然而胞內(nèi)表達(dá)的最大問題是產(chǎn)物形成不溶性的包涵體，雖然這可為后續(xù)的分離純化帶來方便，但包涵體必須經(jīng)過體外復(fù)性才有可能獲得生物活性.絕大部分高表達(dá)的重組蛋白質(zhì)往往聚集成不溶的、無活性的包涵體形式，極大地影響到后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析和活性研究工作，開展對(duì)這些包涵體的復(fù)性工作已成為一個(gè)重要的研究方向。包涵體是由蛋白質(zhì)折疊中間體的聚集而形成的,任何影響中間體穩(wěn)定的因素（如pH值、離子強(qiáng)度、溫度等）都可導(dǎo)致包涵體的形成.包涵體形成原因表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。重組蛋白所處的環(huán)境，發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。蛋白復(fù)性的必要性細(xì)胞中的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)常以可融性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學(xué)活性，因此要獲得具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性。復(fù)性過程是變性蛋白的重折疊過程。對(duì)包涵體蛋白復(fù)性，應(yīng)先對(duì)包涵體進(jìn)行分離純化及去折疊（即變性溶解），然后采用合適的復(fù)性方法促進(jìn)變性，蛋白再折疊進(jìn)而恢復(fù)活性.一. 包涵體的分離純化含包涵體的宿主菌細(xì)胞的破碎；將破碎液離心除去可溶蛋白（9000r15min4°C），獲得包涵體；洗滌包涵體，以除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑，過高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如 2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗滌，溫和去垢劑TritonX-100等洗滌包涵體，然后離心（12000r5min4C）取上清洗滌后包涵體的主要成分為聚合態(tài)的目的蛋白。包涵體的去折疊（即包涵體的溶解）極端pH值、高溫、去污劑、高濃度的無機(jī)鹽或有機(jī)溶劑均可用于溶解包涵體。絕大多數(shù)是采用6mol/L鹽酸胍或8mol/L脲并結(jié)合還原劑來溶解包涵體.高濃度的變性劑可能會(huì)嚴(yán)重破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生不可逆變性，導(dǎo)致無法復(fù)性.因此，包涵體溶解時(shí)要采用盡可能低的變性劑濃度。復(fù)性由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理?xiàng)l件，使蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。包涵體蛋白復(fù)性方法稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子篩填料，柱較長(zhǎng)（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達(dá)90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)?。ㄒ话阄灞蹲笥遥└叩鞍踪|(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質(zhì)的復(fù)性。影響復(fù)性效率的因素：1蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復(fù)性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能導(dǎo)致蛋白重新凝聚。pH：復(fù)性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的二硫鍵的形成，過高或過低會(huì)降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-9.00[12]此外，影響復(fù)性效率的因素還有：溫度（溫度高時(shí)蛋白質(zhì)易發(fā)生凝聚、變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。提高包涵體蛋白的復(fù)性效率氧化-還原轉(zhuǎn)換系統(tǒng)對(duì)于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程應(yīng)能夠促使二硫鍵形成。最常用的氧化交換系統(tǒng)是GSH/GSSG。氧化交換系統(tǒng)通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應(yīng)提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率。通常使用還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊，但可能通過破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進(jìn)劑。蛋白質(zhì)的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質(zhì)的輔因子Zn2域Cu2+可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的折疊中間體，從而防止了蛋白質(zhì)的聚集，加入濃度大于0.4mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。濃度為0.4-0.6ML-Arg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度，可以抑制二聚體的形成。分子伴侶和折疊酶等分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。其它提高復(fù)性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑TritonX-100、磷脂、等對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用；待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助其復(fù)性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的作用，而且具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用。［五.復(fù)性效果的檢測(cè)：檢測(cè)方法1、 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。2、 光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測(cè)。3、 色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，4、 生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。5、 黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。蛋白復(fù)性的流程透析法一、 實(shí)驗(yàn)器材分析天平、燒杯、量筒、磁力攪拌器、pH計(jì)、透析袋、離心機(jī)二、 試劑尿素、Tris-base、NaCl、濃HCl、GSH、GSSG、甘油、精氨酸、G250三、 實(shí)驗(yàn)步驟1.8mol/l尿素溶解包涵體(從蛋白組取得)，離心(12000r4°C5min)，取上清用8mol/l尿素稀釋包涵體到終濃度為0.5mg/ml,取10ul稀釋后溶液與285ulG250顯色，取5ul1mg/ml的BSA溶液與285ulG250顯色，通過對(duì)二者進(jìn)行顏色對(duì)比確定稀釋終點(diǎn)八、、將稀釋液裝入透析袋中，稀釋液與透析液按照1:20的比例進(jìn)行透析，透析液依次為6mol/l尿素pH8.6,4mol/l尿素pH8.5,,3mol/l尿素pH8.4,,2mol/l尿素pH8.3,1.5mol/l尿素pH8.2，,1mol/l尿素pH8.1，,0.5mol/l尿素pH8.0,0mol/l尿素pH8.0，每次換液至少透析6h.改變精氨酸的濃度再進(jìn)行透析，將精氨酸的濃度從0.5mol/1降到0.25mol/l,從0.25mol/l降到0各透析一次對(duì)復(fù)性蛋白進(jìn)行濃縮，將PEG20000撒在透析袋上，4C濃縮到適合體積收集濃縮蛋白，并跑蛋白凝膠，對(duì)蛋白含量進(jìn)行初步定量。注意事項(xiàng)控制包涵體的濃度，不宜偏高或偏低，偏高蛋白易沉淀，偏低則浪費(fèi)試劑。其他物質(zhì)的加入也必須控制比例透析液的pH對(duì)蛋白復(fù)性有較大的影響復(fù)性要在4C進(jìn)行，否則蛋白易積聚沉淀根據(jù)蛋白的穩(wěn)定性確定透析液中是否需要加入EDTA等其他物質(zhì)每次換液透析時(shí)間不得少于6h，否則會(huì)因?yàn)樽冃砸喝コ俣冗^快導(dǎo)致蛋白聚沉加入試劑對(duì)復(fù)性的作用GSH/GSSG:氧化還原系統(tǒng)實(shí)際上給蛋白質(zhì)形成的是一個(gè)還原環(huán)境。正確形成的二硫鍵在這樣的環(huán)境中還是有可能被還原的。。氧化還原系統(tǒng)通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對(duì)的二硫鍵的產(chǎn)率

加入濃度大于0.4mol/LTris緩沖液可提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率精氨酸：1_-入西抑制分子間作用，降低聚集體生成速度，有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度甘油：穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)正確折疊產(chǎn)物的生成試劑配方（1L體系）尿素/gGSH/g2mM/LGSSG/g0.2mMArg/g甘油/mlTris/gNaCl/gPH8mol/l尿素4800.6150.122587.10506.0614.618.06mol/l尿素3600.6150.122587.10506.0614.618.64mol/l尿素2400.6150.122587.10506.0614.618.53mol/l尿素1800.6150.122587.10506.0614.618.42mol/l尿素1200.6150.1225