梅毒螺旋體抗體膠體金法檢測試劑條生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

梅毒螺旋體抗體膠體金法檢測試劑條生產(chǎn)工藝的優(yōu)化【摘要】目的：本課題旨在對梅毒螺旋體抗體膠體金法檢測試劑條生產(chǎn)工藝的優(yōu)化進行研究，將手工生產(chǎn)的模式改為自動化生產(chǎn)。方法：原有的梅毒螺旋體（以下簡稱TP）膠體金檢測試劑條產(chǎn)品是通過人工手工制作而成，現(xiàn)目標通過改進原有的工藝來適應(yīng)和推動TP膠體金檢測試劑條的自動化生產(chǎn)，對TP膠體金檢測法試劑條的各個組分進行篩選和測試，每次實驗都與原工藝作為對照組，得出各組分的最佳濃度范圍和最佳生產(chǎn)條件，將挑選出的各組分搭配進行靈敏度和精密度測試，最終得到符合標準且能自動化生產(chǎn)的新工藝。結(jié)果：實驗表明，T線包被的最佳濃度為0.5mg/mL，C線包被最佳濃度為1.2mg/mL，膜最佳干燥溫度和時間為50℃烘箱干燥20.5h。膠體金標記液最佳濃度選擇為30%，金墊最佳干燥條件為在常溫干燥房中靜置15±3h。樣品墊最佳選擇為YZ-sAb樣品墊V04，將其放置在樣品墊液中飽和浸泡，最佳干燥條件為60±3℃。結(jié)論：新工藝經(jīng)過各個篩選實驗和穩(wěn)定性加速實驗以及大量臨床樣本實驗，改進生產(chǎn)工藝后，新的產(chǎn)品可以通過自動化大規(guī)模生產(chǎn)，且產(chǎn)品質(zhì)量不弱于甚至強于原有的生產(chǎn)工藝，最大可能地節(jié)約成本且生產(chǎn)更加穩(wěn)定更加高效。【關(guān)鍵詞】梅毒螺旋體抗體；膠體金法；生產(chǎn)工藝；優(yōu)化Optimizationofproductionprocessoftreponemalantibodycolloidalgolddetectionstrips[Abstract]Objective:Thisprojectaimstostudytheoptimizationoftheproductionprocessofcolloidalgolddetectionstripsfortreponemalantibodies,changethemodeofmanualproductiontoautomatedproduction.Method:Theoriginaltreponemal(hereinafterreferredtoasTP)colloidalgolddetectionreagentstripproductismadebymanualhand,nowthegoalistoadapttoandpromotetheautomaticproductionofTPcolloidalgolddetectionreagentstripbyimprovingtheoriginalprocess.ForTPcolloidalgolddetectionreagentcomponentsscreeningandtest,eachexperimentwiththeoriginalprocessasacontrolgroup,thecomponentsoftheoptimalconcentrationrangeandoptimalproductionconditions,theselectionofeachcomponentswithsensitivityandprecisiontest,finallymeetthestandardandautomaticproductionofnewtechnology.Results:ExperimentsshowedthattheoptimalTenvelopewas0.5mg/mLandCenvelopewas1.2mg/mL,andtheoptimaldryingtemperatureandtimeofthemembranewere50°Covendryingfor20.5h.Theoptimalconcentrationofcolloidalgoldlabelingsolutionwasselectedas30%,andtheoptimaldryingconditionofthegoldpadwastostandinthedryingroomatroomtemperaturefor15±3h.ThebestchoiceforthesamplepadisYZ-sAbsamplepadV04,whichissaturatedandsoakedinthesamplepadsolutionwithanoptimaldryingconditionof60±3°C.Conclusion:Aftervariousscreeningexperiments,stabilityaccelerationexperimentsandalargenumberofclinicalsampleexperimentsinthenewprocess,thenewproductscanbeproducedonalargescalethroughautomation,andtheproductqualityisnotweakerorevenstrongerthantheoriginalproductionprocess,whichsavescoststothegreatestextentandtheproductionismorestableandefficient.[Keywords]Treponemapallidumantibodycolloidalgoldmethodproductionprocessoptimization目錄1前言 71.1梅毒的國內(nèi)外概況 71.2梅毒的檢測手段 71.3膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展概況及其基本反應(yīng)原理 81.4膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)勢和不足 81.5梅毒膠體金法試劑條產(chǎn)品現(xiàn)生產(chǎn)工藝的缺陷 91.6選題依據(jù)和目標 102實驗 112.1主要材料與試劑 112.2檢測原理和產(chǎn)品結(jié)構(gòu) 112.2.1膠體金法檢測TP基本原理 112.2.2膠體金試劑條的基本結(jié)構(gòu) 122.2.3實驗時觀察指標 122.3金子濃度的選擇 122.3.1確定大量標記的TP金子濃度參數(shù) 132.3.2測試所確定的金子濃度的性能 132.4T線包被濃度最佳參數(shù) 142.5樣品墊的選擇 152.6干燥時間的篩選 162.6.1NC膜干燥時間的選擇以及性能測試 162.6.2金結(jié)合墊干燥時間的選擇以及性能測試 162.6.3樣品墊干燥時間的選擇以及性能測試 172.7匹配濃度 182.7.1綜合匹配濃度 182.7.2自動化工藝匹配濃度 192.8自動化工藝精密度和靈敏度測試 202.9自動化工藝的大量臨床樣本測試 212.10自動化工藝的穩(wěn)定性測試 243總結(jié) 26參考文獻 27致謝 291前言1.1梅毒的國內(nèi)外概況梅毒是由梅毒螺旋體（treponemapallidum,TP）感染引起的一種性傳播疾病[1]。梅毒患者是該疾病的唯一感染源。根據(jù)我國傳染病防治法，該病被列為乙類預(yù)防和管理疾病。梅毒在世界各國的流行率都很高。根據(jù)世界貿(mào)易組織（WTO）的流行病學(xué)統(tǒng)計，全球每年有近1000萬例新病例，主要集中在東南亞、南亞和撒哈拉以南非洲。近年來，梅毒在我國發(fā)展迅速，已成為最常見的新型性病。梅毒患者的皮膚黏膜含有梅毒螺旋體，可通過皮膚或黏膜微破損接觸即可得病，極少數(shù)通過輸血傳染[2]。這些患者中有95%是由于無保護措施的性行為而被感染的。梅毒在早期階段是最具傳染性的，但隨著疾病時間的推移，通常感染梅毒超過四年的患者通過性接觸感染他人的可能性較小。通常，患者在感染梅毒螺旋體后2-3周會出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大和硬下疳。早期癥狀并不明顯，但隨著疾病的推進，會對多個器官組織造成損害。盡早的診療可以控制疾病，避免病情惡化[3]。1.2梅毒的檢測手段梅毒早期的傳染性極強[4]，所以越早診斷越早治療，才能更好地防范梅毒的傳播。近年來，由于人們生活習(xí)慣的改變，梅毒的患病率不斷升高，在梅毒早期的診斷和治療中，最關(guān)鍵的是要篩選出理想的檢測方法。梅毒的臨床癥狀十分復(fù)雜，并且其病原體難以進行人工培養(yǎng)，所以對血清抗體的檢測成為梅毒最重要的診斷依據(jù)之一[5]。在梅毒的診斷方法中，血清學(xué)檢測法能夠給臨床提供重要依據(jù)，其中包括梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA）法、膠體金法等，中國疾控中心推薦梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)法作為梅毒的確證試驗[6]。但是，TPPA法由于成本高昂、操作十分復(fù)雜、且無法實現(xiàn)自動化操作和結(jié)果判讀等，所以TPPA法并不適合用于大規(guī)模篩查。而同時兼具操作簡便和靈敏度較高優(yōu)點的ELISA法、膠體金法，使得這兩種方法更適用于大樣本篩查中。但是，它們在檢測中的結(jié)果表現(xiàn)出的特異性都較差，十分容易出現(xiàn)抗體假陰性的結(jié)果[7-8]。1.3膠體金免疫層析技術(shù)發(fā)展概況及其基本反應(yīng)原理膠體金免疫層析技術(shù)(colloidalgoldimmunochromatographyassay,GICA)是20世紀80~90年代在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集實驗、單克隆抗體技術(shù)、膠體金技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而成的一種新型體外診斷技術(shù)。作為一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測效果的方法，膠體金標記技術(shù)是20世紀未新興的體外診斷技術(shù)，該方法以膠體金作為標記物，通過電鏡觀察對細胞或組織進行免疫學(xué)定位、定性以及定量的研究。20世紀60年代，F(xiàn)eldherr等首次提出膠體金作為一種用于電鏡示蹤標記物[9]。隨后，F(xiàn)aulk和Taylor將膠體金應(yīng)用到免疫組織學(xué)作為示蹤物[10]。免疫膠體金技術(shù)作為一種新型的免疫標記技術(shù)，比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫標記(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)等檢測方法更加方便快捷，基于膠體金示蹤技術(shù)的各種優(yōu)勢，膠體金免疫層析技術(shù)成為了當前檢測發(fā)展的一個熱點。近年來，隨著膠體金免疫層析技術(shù)的迅速發(fā)展，其展現(xiàn)出巨大的檢測優(yōu)勢，解決了實際生活中病責檢測流程復(fù)雜時間長、高損耗的問題[11]。GICA具有簡單快速、判定結(jié)果容易識別、靈敏度高、無污染、攜帶方便等優(yōu)點，現(xiàn)已成為臨床快速診斷領(lǐng)域的一個發(fā)展方向[12]。研究膠體金法檢測梅毒螺旋抗體，優(yōu)化其產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，有利于人們?nèi)粘γ范镜臋z測和監(jiān)控，讓有需要的患者迅速發(fā)現(xiàn)自身的身體情況并及時參與治療，對梅毒的日常防控具有重要的臨床意義。GICA是一種以膠體金作為示蹤標志物來檢測抗原抗體的新型免疫標記技術(shù)[13]。膠體金是氯金酸在還原劑(如檸檬酸、枸櫞酸鈉、白磷、等)的作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，由于靜電作用成為一種穩(wěn)定狀態(tài)的膠體[14]。膠體金在弱堿環(huán)境中帶負電荷，能與蛋白質(zhì)分子正電荷進行極其牢固地結(jié)合，并且不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性。此外，由于結(jié)合物的生物學(xué)及免疫學(xué)特性，膠體金可應(yīng)用在病理學(xué)、組織學(xué)、細胞生物學(xué)及免疫學(xué)等領(lǐng)域。1.4膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)勢和不足膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)擁有的優(yōu)勢：（1）制作成本和購買成本都很低，且整個檢測過程不需要任何特殊的設(shè)備儀器；（2）檢測時間短，從加樣到讀數(shù)整個反應(yīng)過程只需要15分鐘；（3）操作十分簡便，適用于絕大多數(shù)場景，包括基層醫(yī)院和人們?nèi)粘Ｉ钪?；?）可以同時進行多個項目的檢測，在樣本非常難得的情況下，可以節(jié)約樣本；（5）成品標志物物理性質(zhì)十分穩(wěn)定，并且成品可在4℃條件下貯存2年以上，另外其效價無衰減現(xiàn)象；（6）膠體金試劑對機體無毒害，由于膠體金本身就顯紅色或紫紅色，在標記和反應(yīng)過程中不需要加入顯色試劑，省略了酶標儀的致癌性底物和終止液的步驟；（7）可以通過肉眼直接觀察得出檢測結(jié)果。基于以上各個優(yōu)勢，GICA應(yīng)用在梅毒螺旋體特異性抗體的檢測中，過程快速且操作簡便，結(jié)果觀察較為直觀，無需任何特殊儀器設(shè)備，適合各種常見生活場景使用[15]。但目前膠體金免疫層析技術(shù)在應(yīng)用中也有部分缺陷，在判讀試紙條結(jié)果時易受到環(huán)境、標本加樣量及觀察時間等因素的影響，另外，當病原體檢測存在交叉反應(yīng)時，易導(dǎo)致假陰性和假陽性反應(yīng)的出現(xiàn)，在病原多項目聯(lián)合檢測方面尚需提高與加強?；诖耍槍σ陨媳锥?，可從提高試劑盒質(zhì)量、拓寬新型標記材料、實現(xiàn)多項聯(lián)合檢測等方面進行改進，進一步提高免疫膠體金檢測的敏感性、特異性，促使多元檢測及直接定量檢測的早日實現(xiàn)[16]。膠體金技術(shù)在梅毒螺旋體、衣原體、旋毛形線蟲等病原體的檢測中具有重要作用，據(jù)王縛鯤等[17]報道顯示，以梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）結(jié)果為金標準，GICA檢測梅毒螺旋體的準確度、靈敏度、特異度顯著高于ELISA，可快速、準確診斷梅毒螺旋體的感染。1.5梅毒膠體金法試劑條產(chǎn)品現(xiàn)生產(chǎn)工藝的缺陷現(xiàn)企業(yè)中TP檢測試劑條的各個組成成分以及最后的試劑條組裝和裝卡都是手工制作而成，包括膠體金的標記、膠體金結(jié)合墊的涂噴、樣品墊的浸潤和NC膜上TC線的點膜。每個工序都需要不同的人和不同的儀器來操作，首先儀器占用的面積大，然后每臺儀器都需要一定的人員操作，在訂單量加急的特殊情況下生產(chǎn)效率無法得到一定提升。另外由于是人工生產(chǎn)，所以無法保證所有試劑條產(chǎn)品都能保持一樣的精密度和準確度，并且批內(nèi)差和批間差有時也無法保證在合格范圍內(nèi)。1.6選題依據(jù)和目標根據(jù)原生產(chǎn)工藝的缺陷，現(xiàn)推動自動化生產(chǎn)模式的進行。自動化生產(chǎn)模式中，1臺自動化設(shè)備可替代5臺原生產(chǎn)儀器，且1臺新設(shè)備所占面積只有3臺原設(shè)備，最重要的是1臺新設(shè)備只需要2個人就可操作生產(chǎn)；另外生產(chǎn)效率方面，每日的產(chǎn)量遠超原有工藝。原工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品在性能方面滿足要求，現(xiàn)以原工藝配方的各個參數(shù)作為參考，調(diào)整各個成分的參數(shù)，然后用自動化機器進行生產(chǎn)，以原工藝作為對照進行測試，使優(yōu)化后的新工藝能完全適應(yīng)自動化生產(chǎn)?，F(xiàn)目標是通過篩選各個成分，進行測試和調(diào)整，最終得到最優(yōu)的自動化生產(chǎn)新工藝。新工藝所生產(chǎn)的產(chǎn)品，在精密度和準確度測試中、臨床樣本測試中、穩(wěn)定性加速測試中皆能達到標準要求。2實驗2.1主要材料與試劑實驗所有試劑及耗材（見表2-1）：表2-1試劑及耗材名稱規(guī)格備注NC膜M135；M140/TP包被/T線包被羊抗鼠IgG/C線包被TP結(jié)合物TP結(jié)合物01TP標記TP結(jié)合物墊進口2#玻纖/TP58/抗原通用金子稀釋液01/樣品墊SAB全血樣品墊SAb樣品墊液01標準品及指標：質(zhì)控點/標準品顯色指標備注P1≥C2強陽P2≥C5中陽P3C7-C5弱陽稀釋1（L1）≥C31:30稀釋2（L2）≥C51:300稀釋3（L3）C7-C51:1500備注：質(zhì)控品放在-20℃冰箱保存，使用的當天先拿出到4℃冰箱復(fù)溫，使用前半個小時拿出置實驗桌，使其至常溫平衡。2.2檢測原理和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)2.2.1膠體金法檢測TP基本原理本產(chǎn)品檢測原理為雙抗原夾心法,膠體金結(jié)合物為標記物，進行TP抗體的檢測。分別在硝酸纖維素膜（NC膜）上的檢測區(qū)包被包括TP蛋白主要區(qū)段的抗原，膠體金標記同樣的包含TP蛋白主要區(qū)段的標記抗原。檢測時，如果樣品內(nèi)含有TP抗體時，樣品中的TP抗體可與試紙條前端的“膠體金-抗原”結(jié)合，形成“膠體金-抗原-抗體”免疫復(fù)合物，復(fù)合物由于層析作用沿膜帶移動，在T線與抗原相結(jié)合，形成“膠體金-抗原-抗體-抗原”，由于膠體金自顯紫紅色，此時在檢測區(qū)形成一條紅線，判為陽性；如樣品內(nèi)不含TP抗體時，檢測區(qū)不會形成紅色線，判為陰性。2.2.2膠體金試劑條的基本結(jié)構(gòu)膠體金試劑條的結(jié)構(gòu)，其構(gòu)成主要有硝酸纖維素膜（NC膜），膠體金墊，樣品墊，吸水紙，PVC板。（見圖2-2）圖2-2試劑條結(jié)構(gòu)圖2.2.3實驗時觀察指標結(jié)果觀察指標：新工藝即自動化工藝為實驗組，原工藝即張式材料工藝為對照組，以T線顯色作為讀數(shù)，通過與比色卡對照，比色卡上從顏色由深到淺讀數(shù)為C1到C9，每次實驗都是通過實驗組與對照組的顯色結(jié)果對比來判定實驗組是否達到標準。2.3金子濃度的選擇按照操作步驟制備用于標記蛋白的膠體金金顆粒：第一步先將超純水加熱至沸騰狀態(tài)，第二步在保持沸騰狀態(tài)下添加規(guī)定濃度的氯金酸并攪拌一分鐘，第三步加入相應(yīng)比例還原劑檸檬酸三鈉，連續(xù)加熱攪拌五分鐘后，最后停止加熱并持續(xù)攪拌冷卻至室溫備用[18]。膠體金顆粒制備過程中影響因素很多，如反應(yīng)物的投料比、反應(yīng)過程中的溫度和pH值，還有反應(yīng)物加入的時間等多種因素，對膠體金顆粒的制備質(zhì)量都會產(chǎn)生影響。制備過程中使用雙蒸餾水、超純水或去離子水，保證所有玻璃器皿潔凈，防止膠體金溶液制備過程中吸附于容器內(nèi)壁或者發(fā)生集聚現(xiàn)象，影響膠體金顆粒的品質(zhì)，制備良好的膠體金溶液呈現(xiàn)酒紅色[19]。2.3.1確定大量標記的TP金子濃度參數(shù)在干燥房進行試劑條的組裝，將吸水濾紙、膠體金標墊和樣品墊分別粘貼至包被好的PVC板上，用切條機切條裝入塑料卡殼中，壓卡機壓緊，即為雙抗原膠體金免疫層析檢測卡[20]。采用批號為2207250121的NC膜和YZ-sAb樣品墊（2207130042），保證膜和樣品墊不變的情況下，改變金結(jié)合物的濃度，依次使用濃度為20%、25%、30%的金子結(jié)合物，組裝成三種規(guī)格的試劑條，最后到實驗室滴加質(zhì)控品測試，對照批號：J220523713，檢測結(jié)果（如表2-3）：表2-3不同金子濃度測試質(zhì)控品規(guī)格對照20%金子濃度25%金子濃度30%金子濃度P1C1+C1C1+C1+P2C4+C4+C4+C4++P3C7+C7++C6C6L1C1+C2++C1C1+L2C5C5C5C5+L3C7C7C7C7+結(jié)論：考慮到與對照較為接近，選擇金濃度為30%進行噴金。2.3.2測試所確定的金子濃度的性能試劑條的組裝：批號為2207250121的NC膜+YZ-sAb樣品墊（2207130042）+30%的金子結(jié)合物濃度，對照批號：J220523713，檢測結(jié)果（如表2-4）：表2-4濃度28%金子結(jié)合物性能測試質(zhì)控品規(guī)格對照30%金子濃度P1C1+C1+P2C4+C4+P3C6+C6+L1C1C1L2C5+C5L3C7+C7+總結(jié)：金濃度為30%靈敏度符合標準，確定小試金子濃度為30%與對照較為接近。2.4T線包被最佳濃度參數(shù)（1）包被抗原用量的選擇。T線、C線抗原的用量決定了其與標記復(fù)合物結(jié)合的能力，最終決定試劑的顯色，T線包被抗原濃度過低會導(dǎo)致顯色不清晰或中空的現(xiàn)象，T線濃度過高則可能導(dǎo)致C線不顯色或拖帶的現(xiàn)象。因此要對包被抗原的用量摸索驗證，同時對劃膜儀/點膜儀確認，并對點膜工序的各項參數(shù)驗證，明確點膜速度、T線和C線的點膜量等主要參數(shù)。（2）干燥工藝。點膜后要在適宜的溫度和時間內(nèi)干燥，否則會造成顯色不清晰、拖帶、靈敏度下降等情況[21]。（3）現(xiàn)有3個T線包被濃度：分別是0.5mg/mL，0.6mg/mL，0.7mg/mL；另外1個已確定的C線包被濃度為1.2mg/mL；接下來實驗則進行三個T線濃度的篩選。（T0.5/C1.2GXM代表T線濃度為0.5mg/mL，C線濃度為1.2mg/mL）不同條件試劑條的組裝：NC膜上三種T線的參數(shù)：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM；T0.7/C1.2GXM。金子結(jié)合物的參數(shù)：9#20μg/mL,30%(實驗室制備）；9#20μg/mL,30%(自動化機器制備）。樣品墊：YZ-sAb樣品墊。滴加質(zhì)控品進行測試，對照J220523713，測試結(jié)果（如表2-5，表2-6）：表2-5實驗室制備金子測試組質(zhì)控品規(guī)格對照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMT0.7/C1.2GXMP1C1C1C1+C1+P2C4+C3+C3+C3+P3C6+C6+C5C5+L1C1C1C1+C1+L2C4+C4C4+C4+L3C7+C7+C7++C7++表2-6自動化機器制備金子組質(zhì)控品規(guī)格對照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMT0.7/C1.2GXMP1C1C1C1+C1+P2C4+C3+C3+C3+P3C6+C6+C5C5+L1C1C1C1+C1+L2C4+C4C4+C4+L3C7+C7+C7++C7++結(jié)論：T線包被濃度為0.5-0.6mg/mL時與對照較為接近。2.5樣品墊的選擇不同參數(shù)試劑條的組裝：NC膜參數(shù)：T0.5/C1.2GXM自動化干燥24h。金子結(jié)合物參數(shù)：9#20μg/mL,30%(自動化）烘12h后；9#20μg/mL,20%(實驗室）。樣品墊：YZ-sAb樣品墊；YZ-sAb樣品墊V04。滴加質(zhì)控品測試，對照：J220523713，測試結(jié)果（如表2-7）：表2-7兩種樣品墊的測試質(zhì)控品規(guī)格對照YZ-sAb樣品墊+30%金子濃度YZ-sAb樣品墊V04+20%金子濃度P1C1C1C2++P2C4+C3+C3+P3C7+C6+C5+L1C2+C2++C2+L2C5C4C5+L3C7C7+C7+結(jié)論：1.YZ-sAb樣品墊V04比YZ-sAb樣品墊的靈敏度高0.5-1.5個色度；2.更換為V04樣品墊的新工藝需要降低濃度后才能與對照條的新工藝一致；3.使用YZ-sAb樣品墊V04。2.6干燥時間的篩選組成試劑條的各個成分在制作過程中都有不同的生產(chǎn)條件，最重要的必然是各配方濃度的參數(shù)，其次就是其使用前的最后一步干燥，不同的干燥條件生產(chǎn)出的材料會有不同的效果，現(xiàn)進行不同干燥條件的篩選。2.6.1NC膜干燥時間的選擇以及性能測試參數(shù)為T0.5/C1.2GXM的NC膜干燥條件：實驗室干燥24h；自動化設(shè)備干燥20.5h前段；自動化設(shè)備干燥20.5h中段；自動化設(shè)備干燥20.5h后段；自動化設(shè)備干燥22h。干燥溫度為50±3℃。試劑條組裝：金子結(jié)合物為9#20μg/mL,30%(自動化）烘12h后；樣品墊為YZ-sAb樣品墊。實驗室滴加質(zhì)控品測試，對照：J220523713，測試結(jié)果（如表2-8）：表2-8不同干燥條件NC膜的性能質(zhì)控品規(guī)格對照實驗室干燥自動化干燥20.5h前段自動化干燥20.5h中段自動化干燥20.5h后段自動化干燥22hP1C1+C1+C1+C1+C1+C1+P2C4C4+C4+C4+C4+C4+P3C6+C6+C6+C5C5C5L1C1C2++C1C1C1C1L2C4C5C4C4C4C4L3C7+C7+C7++C7++C7++C7++結(jié)論：1.干燥20.5h不同部位、22h的靈敏度差異≤0.5個色度；2.干燥20.5h前段的靈敏度比其他時間和其他部位的靈敏度差異弱。2.6.2金結(jié)合墊干燥時間的選擇以及性能測試加入9#20μg/mL,30%(自動化）金子結(jié)合物的金結(jié)合墊干燥時間：烘12h前段；烘12h中段；烘12h后段；烘15h；烘18h。干燥環(huán)境：干燥房常溫下。NC膜參數(shù)：T0.5/C1.2GXM。樣品墊：YZ-sAb樣品墊。組裝試劑條，滴加質(zhì)控品測試其性能，對照J220523713，測試結(jié)果（如表2-9）：表2-9不同干燥條件金結(jié)合墊的性能質(zhì)控品規(guī)格對照烘12h前段烘12h中段烘12h后段烘15h烘18hP1C1+C1+C1+C1+C1+C1+P2C3C3C3C3C3C3P3C5C5C5C5C5C5L1C1C1C1C1C1C1L2C5+C4C4C4C4C4L3C7+C7++C7++C7++C7++C7+結(jié)論：自動化噴金干燥12h、15h、18h部分濃度點的靈敏度差異≤0.5個色度，確定干燥時間15±3h。2.6.3樣品墊干燥時間的選擇以及性能測試YZ-sAb樣品墊V04的干燥條件參數(shù)：實驗室常溫；自動化57℃；自動化60℃；自動化63℃；自動化66℃。NC膜：T0.5/C1.2GXM。金子結(jié)合墊參數(shù)：9#20μg/mL,30%(自動化）。組裝試劑條，滴加質(zhì)控品測試，對照J220523713，測試結(jié)果（如表2-10）：表2-10不同干燥條件樣品墊的性能質(zhì)控品規(guī)格對照實驗室常溫自動化57℃自動化60℃自動化63℃自動化66℃P1C1C1+C1+C1+C1+C1+P2C4+C3+C3+C3C3C3P3C7C6+C6+C6+C6C6L1C2+C1C1C1C1C1L2C5C4C4C4C4C4L3C7C7+C7+C7C7C7結(jié)論：1.自動化不同溫度干燥（相同干燥時間）的靈敏度差異≤0.5個色度；2.最低溫度57℃和最高溫度66℃的靈敏度均符合要求，且靈敏度差異≤0.5個色度；3.最終選擇干燥溫度為60±3℃。2.7匹配濃度2.7.1綜合匹配濃度結(jié)合上述各個單成分的參數(shù)篩選，現(xiàn)將各個成分的濃度最優(yōu)選進行搭配，篩選出最優(yōu)的自動化工藝。NC膜參數(shù)選擇：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM。金子結(jié)合物參數(shù)選擇：9#20μg/mL,20%（實驗室噴金）；9#20μg/mL,25%(實驗室噴金）；9#20μg/mL,30%(實驗室噴金）；9#20μg/mL,12.5%，4mm(實驗室涂金）；9#20μg/mL,12.5%，5mm(實驗室涂金）；9#20μg/mL,12.5%，6mm(實驗室涂金）。樣品墊參數(shù)：YZ-sAb樣品墊V04；YZ-sAb樣品墊。1、噴金搭配方案：NC膜選T0.5/C1.2GXM；金子結(jié)合物選實驗室噴金的三個濃度；樣品墊選YZ-sAb樣品墊V04，組裝試劑條，滴加質(zhì)控品測試，對照J220523713，測試結(jié)果（如表3-1）：表3-1噴金搭配方案測試結(jié)果質(zhì)控品規(guī)格對照20%25%30%P1C1C2+C2++C1P2C3C5+C4C4+P3C7+C7+C7++C6+L1C1C2+C2++C1L2C5+C6+C6++C5L3C8+C9+C9++C72、涂金搭配方案：NC膜選T0.6/C1.2GXM；金子結(jié)合物選實驗室涂金的三個規(guī)格；樣品墊選YZ-sAb樣品墊，組裝試劑條，滴加質(zhì)控品測試，對照J220523713，測試結(jié)果（如表3-2）：表3涂金搭配方案測試結(jié)果質(zhì)控品規(guī)格對照4mm5mm6mmP1C1C2+C1C1+P2C3C5+C4+C3P3C7+C7+C6+C6++L1C1C2+C1C1L2C5+C7+C5C5+L3C8+C9C7C7+結(jié)論：綜上上述實驗結(jié)果噴金參數(shù)選擇T0.5mg/mL+30%金，涂金參數(shù)選擇T0.6+12.5%金5mm。2.7.2自動化工藝匹配濃度進一步篩選并確定自動化工藝的最佳參數(shù)，主要是NC膜上T線的包被濃度的最終確定。NC膜的選擇：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM。金子結(jié)合物：9#20μg/mL,30%(自動化）12h中卷。樣品墊：YZ-sAb樣品墊V04，實驗室60℃干燥。組裝試劑條，滴加質(zhì)控品測試，對照J220523713，測試結(jié)果（如表3-3）：表3-3自動化工藝匹配質(zhì)控品規(guī)格對照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMP1C1C1C1+P2C3C3C3+P3C6+C6+C6++L1C1C2+C2++L2C5+C6+C5+L3C7+C8+C7+結(jié)論：綜上實驗結(jié)果(加樣量60μL/份次），包被膜匹配濃度選擇T0.5/C1.2GXM符合標準要求且與對照條較為接近。2.8自動化工藝精密度和靈敏度測試經(jīng)前幾步篩選已初步得到自動化工藝的最佳搭配，接下來進行此新工藝的精密度和靈敏度測試。最佳搭配：NC膜：T0.5/C1.2GXM；金子結(jié)合物：9#20μg/mL,30%(自動化）；樣品墊：YZ-sAb樣品墊V04，自動化，60℃。測試方法：按照搭配組裝試劑條；切條，切成規(guī)格寬度4mm的試劑條；裝卡，使用空白長卡新通用卡（6.5CM規(guī)格PVC板），將切好的試劑條裝卡；將質(zhì)控品從冰箱拿出置于實驗臺放至保持室溫平衡；加樣方式：直接加樣品入進樣孔，加樣量：血清80-100ul（3-4滴）；反應(yīng)15分鐘進行讀數(shù)。結(jié)果（如表4-1）：表4-1精密度和靈敏度測試結(jié)果質(zhì)控品規(guī)格對照自動化工藝P1C13/3C1+P2C4+3/3C3+P3C7+3/3C5+L1C2+10/10C1L2C510/10C4L3C710/10C6EL-01B+3/3C8+EL-02C9+3/3C7結(jié)論：1.靈敏度按照最新標準，均符合要求；精密度基本無差異，均符合要求。2.9自動化工藝的大量臨床樣本測試共收新鮮臨床樣本約一千五百例，包括血清樣本和全血樣本，但陰陽性未知，放置4℃冰箱存放。臨床樣本測試方法：（1）按照搭配組裝試劑條成品；（2）切條，切成規(guī)格寬度4mm的試劑條；（3）取出200裸條進行裝卡，使用空白長卡新通用卡（6.5CM規(guī)格PVC板），將切好的試劑條裝卡；另保留1200試劑條無需裝卡，放置干燥房保存；（4）根據(jù)當天任務(wù)量將相應(yīng)數(shù)量的臨床樣本從4℃冰箱拿出置于實驗臺放至保持室溫平衡；（5）加樣方式：直接加樣品入進樣孔，加樣量：血清80-100ul（3-4滴）；全血80-100ul（3-4滴，不上樣時加一滴全血稀釋液）；（6）由于檢測樣本量過多，需要注意反應(yīng)15分鐘馬上進行讀數(shù)，且不可超過20分鐘讀數(shù)。（7）檢測全血樣本時，若由于全血樣本粘稠等原因?qū)е聵颖疚茨茉跈z測膜上爬升時，可適當?shù)渭右坏稳♂屢?；加完全血后若全血放置時間過長或溶血等情況會造成結(jié)果異常或?qū)嶒炇?。檢測總結(jié)果（如表5-1，5-2）：表5-1前兩批血清/血漿臨床樣本檢測結(jié)果(僅記錄陽性)臨床樣本序號（批次）對照自動化工藝3（一）B+C928C2C236C1C152C8C756C5C459C8C860C9C896C1C199C3+C3+102B+B+103C3+C3+111B+B+114C4+C4+129C1C2+6（二）C1C112C7C618C3C224C3C228C9C933B+C937C2C139C2C157C5+C462C9C767C1C169C2C2+74C1C176C5C4+82C9C883B+C894C1C1101C5C4103C7C6109BC9112C4C2116C7C5145C1C1146C4C3154C5C4+155C5C4156C4C4+158C5C4160C2C1163C6C6+166C6C6169C5+C4171C1C1177C9C9表5-2全血臨床樣本檢測結(jié)果(僅記錄陽性)臨床樣本序號（批次）對照自動化工藝70C5C6112C2++C2+123C9C9+125C3C3+小結(jié)：新工藝較對照條靈敏度顯色強0.5-1個色度(共1422例樣本，1287例血清/血漿，135例全血），無假陽現(xiàn)象，新工藝與對照條陰陽符合率都一致。通過大量臨床樣本測試，可知新工藝在性能和準確度完全不弱于甚至強于原工藝。2.10自動化工藝的穩(wěn)定性測試對確定的新工藝的試劑條產(chǎn)品進行最后的加速穩(wěn)定性的測試。加速穩(wěn)定性測試的目的：確保產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)穩(wěn)定有效且保持在一定效價范圍內(nèi)。測試方法：根據(jù)新工藝組裝試劑條；取新工藝試劑條和對照組試劑條，切條，切成規(guī)格寬度4mm的試劑條；將新工藝組和對照組各平均分為2份，分別各取12條裝入鋁箔袋中，每組裝7袋，共4組28袋；分組，貼上標簽，分別是新工藝組中7袋常溫放置，另外7袋50℃烘箱中放置；對照組中7袋常溫放置，另外7袋50℃烘箱放置；標簽寫上放置日期，7袋分別是第1、2、3、4、6、8、10周加速實驗；一周后，將標簽上寫著第一周的新工藝組和對照組放置50℃烘箱中的試劑條取出，放置至室溫；將常溫放置的新工藝組和對照組的試劑條也取出；質(zhì)控品提前從冰箱取出放置至室溫；試劑條裝卡，進行穩(wěn)定性測試；反應(yīng)15分鐘讀數(shù)。結(jié)果指標：同組內(nèi)常溫與50℃加速性能測試的結(jié)果，靈敏度顯色差異在一個梯度內(nèi)且顯色在質(zhì)控標準范圍內(nèi)，表示此周加速實驗中的產(chǎn)品合格；否則，判定為不合格。結(jié)果（如表6-1）：表6-1第一周加速穩(wěn)定性測試結(jié)果質(zhì)控品對照常溫對照50℃新工藝常溫新工藝50℃P1C1C1C1C1P2C4+C4+C3C3P3C6+C6C5+C5+L1C1C1C1C1L21/2C5,1/2C5+1/2C5,1/2C5+C4C4L3C7+C7+C6C6小結(jié)：對照條常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度基本無差異，對照條和新工藝加速第1周均符合標準要求。接下來按第一周方法進行第2、3、4、6、8、10周加速穩(wěn)定性實驗。其結(jié)果（如表6-2）：表6-2第2、3、4、6、8、10周加速實驗測試周序小結(jié)2對照條常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度基本無差異，對照條和新工藝加速第2周均符合標準要求。3對照條常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度基本無差異，對照條和新工藝加速第3周均符合標準要求。4對照條常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度基本無差異，對照條和新工藝加速第4周均符合標準要求。6對照條常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，對照條和新工藝加速第6周均符合標準要求。8對照條常溫與50℃加速的靈敏度L2、L3相差0.5個色度，其他濃度點常溫與加速≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度≤0.5個色度，對照條和新工藝加速第8周均符合標準要求。10對照條常溫與50℃加速的P2和P3相差0.5個色度，其他濃度點常溫與加速≤0.5個色度，新工藝常溫與50℃加速的靈敏度≤1個色度，對照條和新工藝加速第10周均符合標準要求。結(jié)論：經(jīng)10周的加速穩(wěn)定性測試，可得出新工藝在保質(zhì)期內(nèi)穩(wěn)定性良好。3總結(jié)本研究對梅毒螺旋體膠體金檢測法試劑條的各個組分進過自動化機器生產(chǎn)，然后進行篩選和測試，與原工藝作為對照組，得出自動化生產(chǎn)中各組分的最佳濃度范圍和最佳生產(chǎn)條件。實驗表明，T線包被的最佳濃度為0.5mg/mL，C線包被最佳濃度為1.2mg/mL，膜最佳干燥溫度和時間為50±3℃烘箱干燥20.5h。膠體金標記液最佳濃度選擇為30%，金墊最佳干燥條件為在常溫干燥房中靜置15±3h。樣品墊最佳選擇為YZ-sAb樣品墊V04，將其放置在樣品墊液中飽和浸泡，最佳干燥條件為60±3℃。將挑選出的各組分參數(shù)搭配然后進行靈敏度和精密度測試，最終得到符合標準且能自動化生產(chǎn)的新工藝。新工藝所生產(chǎn)的試劑條產(chǎn)品，經(jīng)過大量新鮮臨床樣本（包括血清/血漿，全血）測試，靈敏度比對照組高0-2個梯度但都在質(zhì)控標準范圍內(nèi)，無假陽現(xiàn)象。在10周的加速穩(wěn)定性實驗中，結(jié)果顯示每一周的對照條和新工藝加速均符合標準要求。綜上說明新工藝無論是性能還是準確度，以及穩(wěn)定性都不弱于甚至強于原工藝。自動化新工藝能夠讓梅毒螺旋體膠體金法檢測試劑產(chǎn)品在大規(guī)模生產(chǎn)中更加高效，更加穩(wěn)定，且節(jié)約大量人力物力。新工藝即將投入大規(guī)模的自動化生產(chǎn)中，后續(xù)需要追蹤抽查大規(guī)模生產(chǎn)中新工藝的產(chǎn)品的質(zhì)量。主要參考文獻譚延國,韓強,田野,等.一種化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測梅毒特異性抗體結(jié)果的正確解讀[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2017,14(2):153-155.肖秀美,段京京,吳思沂,等.新型冠狀病毒IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測的假陽性分析[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2020(43):24.趙宗瑞,劉彩霞.四種梅毒檢測方法在梅毒抗體不確定樣本檢測中的應(yīng)用效果評價[J].口岸衛(wèi)生控制,2020,25(1)