實驗三葉綠素含量的測定等課件

實驗三、

葉綠體色素含量的測定（分光光度法和SPAD葉綠素儀法

）

高等植物在光合反應(yīng)中吸收光能的主要色素為葉綠素,其含有的葉綠素a和葉綠素b能將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,形成有機物質(zhì)。因此,葉片中葉綠素含量的高低是反映植物葉片光合能力的一個重要指標(biāo)。一、目的:

了解分光光度計和SPAD葉綠素儀的使用方法；理解分光光度計測定葉綠體色素含量的實驗原理；掌握計算葉綠體各色素成分含量的方法。

實驗三、葉綠體色素含量的測定（分光光度法和SPAD葉綠1要求：2、問答題：（1）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其數(shù)學(xué)表達(dá)式（并說明各符號的代表意義）。Lambert-Beer定律中的比例系數(shù)“K”的物理意義是……？Lambert-Beer定律本身是否有局限性？何謂吸光度的加和性？

（2）葉綠素在蘭光區(qū)的吸收峰高于紅光區(qū)的吸收峰,為何不用蘭光區(qū)的光吸收來測定葉綠素的含量？（3）本實驗為什么要用光路寬度為1cm的比色杯？要求：2二、原理

葉綠素提取液中同時含有葉綠素a和葉綠素b,二者的吸收光譜雖有不同,但又存在著明顯的重疊（如圖）,在不分離葉綠素a和葉綠素b的情況下同時測定葉綠素a和葉綠素b的濃度,可分別測定在665nm和649nm的光吸收,由于在該波長時葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)Lambert-Beer定律,列出濃度C與光密度D之間的關(guān)系式：

D665=83.31Ca+18.60Cb……….(1)D649=24.54Ca+44.24Cb……….(2)

從而計算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的濃度.葉綠素a、b的比吸收系數(shù)波長(nm)葉綠素a葉綠素b66583.3118.6064924.5444.24注：(1)(2)式中的D665、D649為葉綠素溶液在波長665nm和649nm時的光密度。葉綠素a、b的濃度單位為：g/L

二、原理葉綠素提取液中同時含有葉綠素a葉綠素a、b的比吸收3解方程式(1)(2)，則得：Ca=13.7D665—5.76D649

………(3)Cb=25.8D649—7.6D665………..(4)G總=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5)注：此時，Ca、Cb為葉綠素a、b濃度，單位為:mg/L，利用上面（3）（4）(5)式，即可以計算葉綠素a、b含量及總?cè)~綠素的總含量(G總)。

解方程式(1)(2)，則得：注：此時，Ca、Cb為葉綠素a、4

二、材料：

大紅花老葉和嫩葉

三、實驗步驟

1.取新鮮大紅花葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2.稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，暗處靜置3～5min。3.取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5.把葉綠體色素提取液稀釋5倍后倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95％乙醇為參比，在波長665nm、649nm下測定光密度。

二、材料：

大紅花老葉和嫩葉

三、實驗步驟

1.取5四、實驗結(jié)果計算將測定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7D665—5.76D649………(3)Cb=25.8D649—7.6D665………..(4)G總=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5)分別計算葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量Chl（mg/g.FW）=四、實驗結(jié)果計算將測定得到的吸光值代入下面的式子：6原理：

SPAD-502葉綠素儀通過測量葉片在兩種波長光學(xué)濃度差方式650nm和940nm來確定葉片當(dāng)前葉綠素的相對數(shù)量。測量值是通過對在二個不同波長區(qū)域，葉片傳輸光的數(shù)量進行計算，在這二個區(qū)域葉綠素對光吸收不相同的。這二個區(qū)域是紅光區(qū)(對光有較高的吸收且不受胡蘿卜素影響)和紅外線區(qū)(對光的吸收極低)開機調(diào)零測量1測量2測量3求平均值原理：開機調(diào)零測量1測量2測量3求平均值7一分光光度計的工作原理：

分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。一分光光度計的工作原理：8二分光光度計的基本常識：1、紫外光分光光度計，其使用波長在190－400nm,可見光分光光度計，其使用波長在400－800nm。2消光系數(shù)：是溶液對光吸收的比例常數(shù)，指在一定的濃度和波長等條件下物質(zhì)的光吸收值，用K表示。它取決于溶質(zhì)性質(zhì)、入射光波長和溫度。消光度（也叫光密度OD，或吸光值A(chǔ)）：表示溶液吸收光的強弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液對光吸收的程度愈大。透光率（用T表示）：是透射光強度（透過比色皿）與入射射光強度（還未過比色皿之前的光強度）之比（用T=It/I0表示）

。二分光光度計的基本常識：9三、分光光度計的基本維護及使用注意事項：1分光光度計必須放置在固定且不受震動的儀器臺上，不能隨意搬動。嚴(yán)防震動、潮濕和強光直射。2分光光度計內(nèi)放有硅膠干燥袋應(yīng)定期更換。3儀器連續(xù)使用時間不應(yīng)超過2小時，每次使用需歇半小時以上才能再用。用完儀器后，務(wù)必關(guān)避電源開關(guān)，拔下插頭。清理儀器上的雜物（包括灰塵、水嘖、溶液等）。4千萬不可用手、濾紙、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。不允許用酒精、汽油、乙醚等有機溶液擦洗儀器。5盛待液時，必須達(dá)到比色杯的2/3左右，不宜過多。用完比色杯后應(yīng)立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。6每套分光光度計上的比色杯及比色槽不得隨意更換。7測定某未知待測液時，先制作該溶液的吸收光譜曲線，再選擇最大峰的波長作為測定的波長。一般所制成的溶液應(yīng)盡量使光密值在0.1－0.7的范圍內(nèi)測定。三、分光光度計的基本維護及使用注意事項：10VIS-723N可見分光光度計

比色皿校正和多波長測定操作步驟：1.在主菜單下選擇“2光度測量”主菜單1波長掃描2光度測量3定量分析4時間掃描5實時測量6系統(tǒng)設(shè)置

3.比色皿配對完成后，按“RETURN”鍵退回光度測量參數(shù)設(shè)置界面。4.按F2開始測量?？砂凑掌聊簧系奶崾具M行測量操作，當(dāng)有多個樣品需要測量時，可測完一個后再按“F2”測下一個。注意樣品的編號N值必須和比色皿的編號一致。2.按“F1”進行比色皿的校正，輸入除參比杯外的比色杯個數(shù)后按“ENTER”鍵，再按“F2”，根據(jù)儀器提示進行操作即可。VIS-723N可見分光光度計

比色皿校正和多波長測定11AM-300手持式葉面積儀測定葉面積原理：內(nèi)置固體標(biāo)準(zhǔn)光源的CCD掃描系統(tǒng)開機,按住電源開關(guān)1秒

選擇顯示方向

放入材料（不能直接接觸探頭）

按住探頭上紅色button,直至發(fā)出兩種連續(xù)蜂鳴,屏幕提示“measure”可開始測量探頭從材料上方勻速滑過，等屏幕顯示出完整葉片形狀后再次按紅色button結(jié)束測量AM-300手持式葉面積儀測定葉面積原理：內(nèi)置固體標(biāo)準(zhǔn)光源的12植物葉面積的測定（畫紙稱重法）

將所測葉片放在厚度均勻的稱量紙上，用鉛筆將葉形畫好，剪下所畫的紙葉，在電子天平上稱重，記為W1；另取10*10cm2的紙片，稱重記為W2；則所測葉片面積X可按下面公式計算出。X（cm2）＝W1/W2×100植物葉面積的測定（畫紙稱重法）13CB-1102便攜式光合蒸騰測定儀CB-1102便攜式光合蒸騰測定儀14特點：非破壞性測量，即不離體測量具有開路和閉路測量兩種光合測量方式可以手動或自動測量，可編程自動定時測量全部測量參數(shù)和計算結(jié)果可以存貯，并通過RS232接口傳輸?shù)接嬎銠C特點：非破壞性測量，即不離體測量15原理：利用紅外CO2分析器和濕度傳感器對參考?xì)夂土鹘?jīng)葉室后的測量氣進行測量，根據(jù)CO2濃度差和濕度差以及流量等參數(shù)，利用氣體通量公式，分別計算凈光合（或呼吸）速率和蒸騰速率。原理：利用紅外CO2分析器和濕度傳感器對參考?xì)夂土鹘?jīng)葉