細菌生物被膜的培養(yǎng)、觀測和耐藥性評測技術(shù)指南

細菌生物被膜的培養(yǎng)、觀測和耐藥性評測技術(shù)指南TechnicalGuidelinesonBiofilmCultivation,ExaminationandResistanceEvaluation1適用范圍

本指南規(guī)定了細菌生物被膜培養(yǎng)、觀測和耐藥性評測技術(shù)的實驗條件要求、實驗設(shè)計、實施與驗證等技術(shù)要求。本指南可作為實驗室細菌生物被膜培養(yǎng)與構(gòu)建、觀測與定量、以及耐藥性評估等工作的技術(shù)依據(jù)。根據(jù)《中華人民共和國專利法》，對于本指南中所涉及專利技術(shù)（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需獲得專利權(quán)所有人書面許可。2術(shù)語和定義2.1

生物被膜：指細菌粘附于生物或非生物基質(zhì)表面，分泌胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA等，將細菌細胞保護于其中而形成的膜狀細菌群落。2.2交叉感染：細菌或其他微生物從一種物質(zhì)或物體轉(zhuǎn)移到另一種物質(zhì)或物體并產(chǎn)生有害影響的過程。2.3ColonyFormingUnit(CFU):菌落形成單位，是一種活細菌細胞數(shù)量的測量方法，以CFU/mL為單位。2.4群體感應(yīng)：指一種細菌細胞間的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，群體感應(yīng)在多種致病菌中控制毒力因子的合成。3細菌生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標準以下生物被膜培養(yǎng)方法與技術(shù)標準均以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種培養(yǎng)以及實驗條件可按需求適當調(diào)整。3.1體外生物被膜培養(yǎng)(invitrostaticbiofilm)3.1.1體外靜態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-孔板培養(yǎng)法準備以下材料：無菌96孔板（或24孔板,Nest/Corning）；無菌儲液器；100uL排槍移液器（或1mL移液器）；15mL無菌搖菌管；100uL（或1mL）移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；無菌ddH2O；無菌生理鹽水；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基和移液器槍頭在121℃高溫高壓滅菌15-30分鐘，取出并將槍頭干燥備用。將目標菌株接種至適當體積的LB培養(yǎng)基（例：如所需菌量不多，可接種2mL；所需菌量須以最終所需菌液體積計算）中，按所需溫度（例：銅綠假單胞菌需37℃或丁香假單胞菌需30℃等）200rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05，將稀釋好的菌液傾倒入無菌儲液器，用排槍移液器將100uL稀釋菌液加入96孔板孔洞中（或1mL移液器將1mL稀釋菌液加入24孔板孔洞中），每株菌至少三個重復。將加入菌液的孔板在所需溫度下靜置培養(yǎng)至少16小時，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150μLddH2O（結(jié)晶紫染色）或無菌生理鹽水（死活菌熒光染色）洗兩次，移除所有液體，生物被膜生長于孔壁上?？装迮囵B(yǎng)法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用排槍反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差；孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；移除廢液以及清洗生物被膜時須注意不可用槍頭觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。3.1.2體外動態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-玻璃珠培養(yǎng)法準備以下材料：無菌24孔板；無菌儲液器；1mL移液器15mL無菌搖菌管；1mL移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；鑷子；3-5mm玻璃珠；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基、移液器槍頭、鑷子和玻璃珠在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將槍頭、鑷子與玻璃珠干燥備用。將目標菌株接種至適當體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm震蕩培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05。用無菌鑷子將兩枚玻璃珠轉(zhuǎn)移至同一個24孔板孔洞內(nèi)，將菌液傾倒入儲液器內(nèi)，在每個孔洞中加入1mL稀釋菌液，每株菌至少三個重復。將加入菌液與玻璃珠的孔板在所需溫度下，100rpm轉(zhuǎn)速搖晃培養(yǎng)至少16小時，以形成生物被膜。生物被膜在玻璃珠表面形成后，準備新的24孔板，在孔洞內(nèi)加入1mLddH2O，用無菌鑷子小心將玻璃珠移入備有ddH2O的24孔板孔洞內(nèi)，慢搖一分鐘清洗，重復此清洗步驟兩次，將玻璃珠取出置入新的24孔板中，生物被膜附著于玻璃珠表面。玻璃珠培養(yǎng)法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用移液器反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差；孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時菌液濺出造成交叉污染；用無菌鑷子轉(zhuǎn)移玻璃珠時，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；孔板培養(yǎng)生物被膜需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；3.1.3體外靜態(tài)/動態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-玻片培養(yǎng)法準備以下材料：無菌培養(yǎng)皿（靜置培養(yǎng)需準備6孔板）；15mL無菌搖菌管；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）所需菌株；廢液桶；75%酒精；鑷子；載玻片；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基、移液器槍頭、鑷子和載玻片在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將槍頭、鑷子與載玻片干燥備用。將目標菌株接種至適當體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01，將無菌載玻片置入培養(yǎng)皿底部，將稀釋菌液傾倒入培養(yǎng)皿，將載玻片于所需溫度下，100rmp搖晃培養(yǎng)至少16小時，以形成生物被膜（如需靜置培養(yǎng)，可將玻片斜插入孔板中，靜置培養(yǎng)16小時以上，形成生物被膜）。生物被膜形成后，用無菌鑷子小心將載玻片轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，用1mLddH2O沖洗載玻片至少3次，移除所有廢液，重復清洗步驟兩次。將載玻片轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，生物被膜附著于載玻片表面。玻片培養(yǎng)法技術(shù)標準:所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染；培養(yǎng)皿內(nèi)菌液不可過多，以免搖晃培養(yǎng)時菌液濺出造成污染；用無菌鑷子轉(zhuǎn)移載玻片時，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性；搖晃培養(yǎng)時需用透氣封口膜密封培養(yǎng)皿防止液體蒸發(fā)。3.1.4體外動態(tài)生物被膜培養(yǎng)方法-Peglid培養(yǎng)法準備以下材料：96孔板；Peglid蓋子（見附錄圖三）;無菌儲液器；100uL排槍移液器；15mL無菌搖菌管；100uL（或1mL）移液器槍頭；LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；所需菌株；廢液桶；75%酒精；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；無菌生理鹽水；培養(yǎng)步驟如下：首先將LB培養(yǎng)基和移液器槍頭在121℃高溫高壓滅菌15-30分鐘，取出并將槍頭干燥備用。將目標菌株接種至適當體積的LB培養(yǎng)基（例：如所需菌量不多，可接種2mL；所需菌量須以最終所需菌液體積計算）中，按所需溫度（例：銅綠假單胞菌需37℃或丁香假單胞菌需30℃等）200rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.01-0.05，將稀釋好的菌液傾倒入無菌儲液器，用排槍移液器將100uL稀釋菌液加入96孔板孔洞中，每株菌至少三個重復，將peglid小心蓋入菌液中，將孔板在所需溫度下100rpm震蕩培養(yǎng)至少16小時，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150uLddH2O洗兩次，移除所有液體，生物被膜生長于peglid中下端。Peglid培養(yǎng)法技術(shù)標準:所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染；在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用排槍反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差；孔洞內(nèi)菌液不可過多，以免置入peglid或震蕩培養(yǎng)時菌液濺出造成污染；需保證培養(yǎng)后孔洞內(nèi)剩余菌液體積基本一致，培養(yǎng)時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發(fā)；移除廢液以及清洗生物被膜時須注意不可觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。3.2體外流式生物被膜培養(yǎng)3.2.1體外流式生物被膜培養(yǎng)方法-管式培養(yǎng)法（tubing-biofilm）準備以下材料：15mL無菌搖菌管；長50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤澤）；長25cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤澤），雙端安裝等徑直通接頭；長15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管（潤澤）；長10cm，內(nèi)直徑3.2mm硅膠管（潤澤）；雙端安裝等徑直通接頭；長30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管（潤澤）；2個2L玻璃培養(yǎng)瓶；10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；過濾器（過濾孔0.22μm）；無阻泵（aperistalticpump，MasterFlex）；所需菌株；醫(yī)用尖銳物處理容器；75%酒精；鑷子；5mL無菌針管；無菌針頭；移液器；無菌移液管；管式培養(yǎng)系統(tǒng)搭建：首先將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖一所示，在無菌操作臺中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管b連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無阻泵、過濾器、硅膠管c,d,e,f，2L廢液罐，同個裝置內(nèi)至少三個平行（圖內(nèi)展示一個平行），將整個系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。圖一.管式培養(yǎng)法示意圖。培養(yǎng)步驟如下：將目標菌株接種至適當體積的LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無菌針管吸入2mL稀釋菌液，并將稀釋菌液分別注入硅膠管b平行裝置中，用硅膠封口后靜置培養(yǎng)2小時使細菌細胞粘附于管壁,用10%LB流動培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜。管式培養(yǎng)法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染;使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；保證無阻泵運行速度一致，避免液體回流造成污染；保證硅膠管管壁厚度適宜，造成管壁破裂，影響生物被膜形成；在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；3.2.2體外流式生物被膜培養(yǎng)方法-池式培養(yǎng)法（flow-cellbiofilm）準備以下材料：15mL無菌搖菌管；三通道培養(yǎng)池（3-channelflow-cell）與樹脂蓋；長50cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；長25cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管，雙端安裝等徑直通接頭；長15cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠管；長30cm，內(nèi)直徑1.0mm硅膠泵管；2個2L玻璃培養(yǎng)瓶；10%LB培養(yǎng)基（可按需使用其他培養(yǎng)基）；過濾器（過濾孔0.22μm）；無阻泵（aperistalticpump）；所需菌株；醫(yī)用尖銳物處理容器；75%酒精；鑷子；5mL無菌針管；無菌針頭；移液器；無菌移液管；池式培養(yǎng)系統(tǒng)搭建：首先將三通道培養(yǎng)池與蓋子緊密黏結(jié)晾干。將裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、三通道培養(yǎng)池、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將培養(yǎng)池、硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖二所示，在無菌操作臺中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管c連接裝有培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶、無阻泵、過濾器、培養(yǎng)池（三個平行），硅膠管c,d,e,f，2L廢液罐，將整個系統(tǒng)置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。圖二.池式培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。培養(yǎng)步驟如下：將目標菌株接種至LB培養(yǎng)基中，在所需溫度下200rpm搖晃培養(yǎng)過夜。在無菌操作臺中，用新鮮LB培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無菌針管吸入1mL稀釋菌液，將600μL稀釋菌液分別從培養(yǎng)池前硅膠管約1cm處注入培養(yǎng)池三個通道內(nèi)，用硅膠封口后翻轉(zhuǎn)靜置培養(yǎng)2小時使細菌細胞粘附于樹脂池蓋,用10%LB流動培養(yǎng)基培養(yǎng)3至7天，建立生物被膜。池式培養(yǎng)法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染;使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員；將使用過的針管與針頭丟棄入醫(yī)用尖銳物處理容器統(tǒng)一處理，避免誤傷操作人員；保證無阻泵運行速度一致，避免液體回流造成污染；保證培養(yǎng)池翻轉(zhuǎn)狀態(tài)，以免影響生物被膜形成；黏結(jié)培養(yǎng)池與池蓋時須小心不可將池蓋壓破，并須保證培養(yǎng)池與池蓋完全密封，避免菌液與培養(yǎng)基溢出造成污染；保證培養(yǎng)池所有通道暢通，避免堵塞造成液體回流與污染；在培養(yǎng)過程中如需添加培養(yǎng)基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染；培養(yǎng)瓶口須用透氣封口膜密封防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。細菌生物被膜定量與觀測技術(shù)與標準4.1生物被膜定量技術(shù)與標準4.1.1生物被膜定量技術(shù)-結(jié)晶紫染色法結(jié)晶紫染色法適用于孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和Peglid培養(yǎng)的生物被膜。準備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)或玻片的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.2、3.1.3和3.1.4培養(yǎng)方法）；1%結(jié)晶紫溶液；ddH2O；30%冰醋酸；96孔板；24孔板；100μL排槍移液器（或1mL移液器）；100μL（或1mL）移液器槍頭；鑷子；廢液罐；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在每個附著有生物被膜的96孔板孔洞中加入125μL的1%結(jié)晶紫溶液（24孔板孔洞中加入1.25mL），室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，移除結(jié)晶紫溶液，用ddH2O徹底沖洗多余的結(jié)晶紫溶液，室溫風干。在每個孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測量結(jié)晶紫染色吸光度來相對定量生物膜形成。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在每個24孔板孔洞中加入1mL的1%結(jié)晶紫溶液，將附著生物被膜的玻璃珠置入孔洞內(nèi)，室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，移除結(jié)晶紫溶液，準備新的24孔板，在每個孔洞中加入1.25mLddH2O，將染色后的玻璃珠置入新的24孔板孔洞中，慢搖清洗多余的結(jié)晶紫溶液，重復清洗步驟三次，將玻璃珠移入新的24孔板孔洞中室溫風干。在每個孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫，移除玻璃珠。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測量結(jié)晶紫染色吸光度來相對定量生物膜形成。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將動態(tài)培養(yǎng)的玻片生物被膜置于培養(yǎng)皿底部，將1%結(jié)晶紫溶液滴在生物被膜表面，保證完全覆蓋生物被膜（靜態(tài)培養(yǎng)的玻片生物被膜可斜置于盛有1%結(jié)晶紫溶液的6孔板孔洞內(nèi)，保證結(jié)晶紫溶液完全沒過生物被膜），室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，取出玻片，用2mLddH2O重復沖洗玻片至少步驟三次，洗除多余結(jié)晶紫溶液。將玻片室溫風干，在6孔板每個孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，將染色后的生物被膜浸入冰醋酸中溶解，吸取冰醋酸輕輕吹打溶解未浸入的生物被膜。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測量結(jié)晶紫染色吸光度來相對定量生物膜形成。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在96孔板孔洞中加入125uL的1%結(jié)晶紫溶液，將附著有生物被膜的peglid小心置入96孔板內(nèi)，室溫靜置15-30分鐘染色。染色后，將peglid轉(zhuǎn)移至含有125uLddH2O的新96孔板內(nèi)，100rpm慢搖清洗3分鐘，重復清洗步驟三次去除多余的結(jié)晶紫溶液，將peglid室溫風干。取新的96孔板，在每個孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，將peglid置入孔板內(nèi)，100rpm室溫慢搖3分鐘溶解結(jié)晶紫。取出peglid，蓋好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm測量結(jié)晶紫染色吸光度來相對定量生物膜形成。結(jié)晶紫染色法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守標準操作流程，在操作醋酸過程中，需嚴格遵守標準操作流程，避免誤傷操作人員;染色過程中，結(jié)晶紫溶液體積須覆蓋全部生物被膜生長區(qū)域，減少誤差；染色后，須徹底沖洗懸浮的結(jié)晶紫溶液，減少誤差；移液過程中，須注意不可用移液器槍頭直接觸碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；結(jié)晶紫溶液廢液與醋酸溶液廢液須分別傾倒至指定廢液罐內(nèi)另行處理，不可隨意傾倒或按照普通液體處理；4.1.2生物被膜定量技術(shù)-死活菌細胞（Syto9/PI）染色法此方法適用于孔板培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和流式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可染色定量生物被膜內(nèi)的活菌細胞和死菌細胞。準備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和流式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.3和3.2培養(yǎng)方法）；96孔板；培養(yǎng)皿；100uL移液器（或1mL移液器）；100uL（或1mL）移液器槍頭；注射器及注射針頭；鑷子；廢液罐；活死細胞染色試劑盒（L7012,Thermofisher,USA）或Syto9/PI染色劑（S34854,P3566,Thermofiser,USA）0.85%氯化鈉溶液操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：將每個附著有生物被膜的96孔板孔洞沖洗后，加入125μLSyto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)室溫靜置避光染色15分鐘。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對定量。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將附著有生物被膜的玻片置于培養(yǎng)皿中，加入適量Syto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)，以覆蓋住生物被膜生長區(qū)域為宜，室溫靜置15分鐘染色。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對定量。池式培養(yǎng)的生物被膜：用燕尾夾將附著有生物被膜的培養(yǎng)池流入端和流出端的硅膠管固定后，將培養(yǎng)池從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出，置于水平臺面上。將流出端燕尾夾移除，用注射器將0.5mLSyto9/PI染色劑（工作濃度為3.34μM/20mM)緩慢地從流入端注射進入培養(yǎng)池中，注射完畢后將流出端用燕尾夾固定。室溫靜置避光染色15分鐘染色。用熒光顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)并相對定量。Syto9/PI染色法技術(shù)要點：用熒光顯微鏡觀察生物被膜需要使用共聚焦培養(yǎng)皿類的平板，例如8-wellμ-slides(80826，ibidi)所有操作須嚴格遵守標準操作流程，在操作染色劑過程中，需嚴格遵守標準操作流程，避免誤傷操作人員;染色過程中，染色液體積須覆蓋全部生物被膜生長區(qū)域，減少誤差；移液過程中，須注意不可用移液器槍頭直接觸碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；染色完成后，應(yīng)避免劇烈震蕩，并須注意在三小時內(nèi)進行熒光顯微鏡觀察，以免生物被膜結(jié)構(gòu)收到損傷而造成誤差；染色液廢液須傾倒至指定廢液罐內(nèi)另行處理，不可隨意傾倒或按照普通液體處理；4.1.3生物被膜定量技術(shù)-CFU計數(shù)法此方法適用于孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可檢測生物被膜中存活的細菌數(shù)量。準備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)、玻片培養(yǎng)、peglid培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.1、3.1.2、3.1.3、3.1.4和3.2.1培養(yǎng)方法）；24孔板；無菌培養(yǎng)皿；無菌刮刀；2mL和10mL無菌離心管；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；LB瓊脂平板（或按菌株需要，準備其他培養(yǎng)基瓊脂平板）100μL移液器和1mL移液器；100μL和1mL移液器槍頭；10mL無菌針管；鑷子；廢液罐；超聲水浴儀（Elma,ElmasonicP120H）；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的孔板孔洞內(nèi)加入150μLddH2O（如用24孔板，則加入1.25mLddH2O）清洗兩次去除懸浮細菌，移除所有上清液，再加入100uLddH2O（如用24孔板，則加入1mLddH2O）。將孔板用透氣封口膜密封，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過高。超聲后，將孔洞內(nèi)菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100μL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個重復，將涂好的平板在無菌操作臺中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時，取出平板計算菌落數(shù)量以定量孔板生物被膜中的細菌量。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的玻璃珠置于24孔板空洞內(nèi)，每孔兩個珠子。加入1.5mLddH2O清洗兩次去除懸浮細菌。用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過高。超聲后，將玻璃珠小心移除，把孔洞內(nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至2mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心5分鐘，移除上清液并將細菌重懸在1mLddH2O中。以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個重復，將涂好的平板在無菌操作臺中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時，取出平板計算菌落數(shù)量以定量玻璃珠生物被膜中的細菌量。玻片培養(yǎng)的生物被膜:在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的玻片置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌刮刀將附著在玻片上的的生物被膜輕輕刮下，轉(zhuǎn)置于2mL無菌離心管內(nèi)，加入1mLddH2O并用移液槍反復吹打生物被膜細菌。用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過高。超聲后，5000rpm室溫離心5分鐘，移除上清液并將細菌重懸在1mLddH2O中。以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100μL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個重復，將涂好的平板在無菌操作臺中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時，取出平板計算菌落數(shù)量以定量玻片生物被膜中的細菌量。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的peglid置入含有125uLddH2O的96孔板內(nèi)，100rpm慢搖清洗兩次去除懸浮細菌。將peglid轉(zhuǎn)移至新的含有100uLddH2O的96孔板內(nèi)，將孔板用透氣封口膜密封，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過高。超聲后，移出peglid，將孔洞內(nèi)菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個重復，將涂好的平板在無菌操作臺中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時，取出平板計算菌落數(shù)量以定量孔板生物被膜中的細菌量。管式培養(yǎng)的生物被膜：將附著有生物被膜的硅膠管從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出。在無菌操作臺中，用兩支10mL無菌針管，分別吸入2.5mLddH2O，將針管分別小心插入硅膠管兩端，從一側(cè)慢慢將ddH2O注入硅膠管內(nèi)，將生物被膜推入另一側(cè)針管內(nèi)，兩側(cè)交替重復此步驟數(shù)次至完全洗脫生物被膜。將洗脫的生物被膜轉(zhuǎn)移至10mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心3分鐘并移除上清液，用2mLddH2O清洗兩次生物被膜并重新懸浮在1毫升ddH2O內(nèi)，用超聲水浴儀，在37kHz，100%power，震蕩10分鐘。在水浴儀內(nèi)加冰以防止溫度過高。超聲后，將菌液以10倍連續(xù)稀釋至10-7，從10-4至10-7稀釋液中取100uL涂布在LB瓊脂平板上，至少三個重復。將涂好的平板在無菌操作臺中晾干表面，在所需溫度下將涂有菌液的平板靜置培養(yǎng)至少16小時，取出平板計算菌落數(shù)量以定量管式生物被膜中的細菌量。CFU計數(shù)法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染;所有超聲破碎步驟須在冰上操作或在儀器中加入碎冰以保持低溫，避免溫度過高影響細菌活性；此處使用的超聲水浴條件只限于CFU計數(shù)法使用，如后續(xù)需進行其他步驟，超聲條件須按需調(diào)整；涂布稀釋菌液須選擇多個稀釋濃度，靜置培養(yǎng)后選擇菌落數(shù)量在30-300個的稀釋濃度作為計數(shù)濃度，避免菌落數(shù)量過低或過高導致誤差；涂布好的平板在培養(yǎng)前須晾干表面，并在培養(yǎng)過程中倒置與培養(yǎng)箱內(nèi)，避免生成水珠滴在平板表面，影響計數(shù)結(jié)果；如細菌須36小時以上的培養(yǎng)時間，須用透氣封口膜密封平板，防止瓊脂蒸發(fā)造成干裂影響計數(shù)結(jié)果。4.1.4生物被膜定量技術(shù)-干重/濕重定量法此方法適用于玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜。此方法可計算生物被膜內(nèi)所有物質(zhì)總重量，包括細菌、胞外多糖等。準備以下材料：玻片培養(yǎng)和管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.1.3和3.2.1培養(yǎng)方法）；無菌培養(yǎng)皿；無菌刮刀；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；2mL和10mL無菌離心管；100μL移液器和1mL移液器；100μL和1mL移液器槍頭；10mL無菌針管；廢液罐；SpeedVac恒溫干燥儀；操作流程：玻片培養(yǎng)的生物被膜:先將準備好的2mL無菌離心管稱重并記錄。在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的玻片置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌刮刀將附著在玻片上的的生物被膜輕輕刮下，轉(zhuǎn)置于2mL無菌離心管內(nèi)，將生物被膜樣品在5000rpm室溫狀態(tài)下離心3分鐘，移除所有上清液。將離心管外壁擦拭干凈并晾干后稱重，用總重量減去離心管重量可得到生物被膜濕重。（若需生物被膜干重，將生物被膜離心并移除上清液后，在SpeedVac恒溫狀態(tài)下將生物被膜徹底干燥后稱重定量，干燥溫度可按實驗需求設(shè)定，如需低溫4℃或室溫25℃等）管式培養(yǎng)的生物被膜：先將準備好的10mL無菌離心管稱重并記錄。在無菌操作臺中，將附著有生物被膜的硅膠管從培養(yǎng)系統(tǒng)中小心取出，用兩支10mL無菌針管，分別吸入2.5mLddH2O，將針管分別小心插入硅膠管兩端，從一側(cè)慢慢將ddH2O注入硅膠管內(nèi)，將生物被膜推入另一側(cè)針管內(nèi)，兩側(cè)交替重復此步驟數(shù)次至完全洗脫生物被膜。將洗脫的生物被膜轉(zhuǎn)移至10mL離心管內(nèi)，5000rpm室溫離心3分鐘并移除上清液，將離心管外壁擦拭干凈并晾干后稱重，用總重量減去離心管重量可得到生物被膜濕重。（若需生物被膜干重，將生物被膜離心并移除上清液后，在SpeedVac恒溫狀態(tài)下將生物被膜徹底干燥后稱重定量，干燥溫度可按實驗需求設(shè)定，如需低溫4℃或室溫25℃等）干重/濕重定量法技術(shù)要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染;如需測生物被膜濕重，須盡量移除所有上清液，以避免上清液遺留太多影響稱重結(jié)果或造成誤差過大；如需測量生物被膜濕重，并進行后續(xù)實驗，所有操作步驟溫度需要嚴格按照實驗需求設(shè)定，避免影響后續(xù)分析；如需測量生物被膜干重，并進行后續(xù)實驗，所有操作步驟以及干燥溫度須嚴格按照實驗需求設(shè)定，避免影響后續(xù)分析；離心后，須將離心管外壁的水汽徹底干燥后再稱重，避免凝結(jié)的水汽影響稱重結(jié)果或造成誤差過大。4.1.5生物被膜定量技術(shù)-3D成像COMSTAT/IMARIS定量法此方法適用于激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝的生物被膜。準備以下材料：激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝的3D生物被膜圖像（參考4.2.1觀測方法）；操作流程：Comstat2定量分析：用ImageJ軟件打開激光共聚焦熒光顯微鏡圖像，將原始文件格式轉(zhuǎn)為OME-Tiff格式，并將同一分組的所有OME-Tiff文件存在同一個子文件夾內(nèi)；打開Comstat2分析軟件，將文件夾路徑指定為保存好的子文件夾，導入該分組的所有OME-Tiff圖像文件；設(shè)置threshold，計算Biomass,surfacecoverage,thickness等生物被膜形態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵參數(shù)。Imaris定量分析：打開Imaris軟件進入Arena功能區(qū)，將要分析的圖像文件所在的文件夾導入Arena功能區(qū)，選擇其中一個圖像，調(diào)整threshold并保存參數(shù)，回到Arena功能區(qū)，用保存的參數(shù)進行batchprocessing。3D成像COMSTAT/IMARIS定量法技術(shù)要點使用batchprocessing之前，threshold要逐一查看，以免引起計算誤差調(diào)整完參數(shù)的文件需要另存為副本，以免造成原始文件覆蓋使得信息丟失4.2生物被膜觀測技術(shù)與標準4.2.1生物被膜觀測技術(shù)-激光共聚焦熒光顯微鏡觀察法此方法適用于熒光染色或熒光標記的玻片培養(yǎng)及池式培養(yǎng)的生物被膜。準備以下材料：玻片培養(yǎng)以及池式培養(yǎng)的具有熒光蛋白標記的生物被膜樣本（參考3.1.3和3.2.2培養(yǎng)方法），或熒光染色的玻片培養(yǎng)以及池式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考4.1.2染色方法）操作流程：將生物被膜樣本置于激光共聚焦熒光顯微鏡的載物臺上，通過光學目鏡找到合適的視野和焦點；選擇熒光蛋白/熒光染色劑匹配的激光源和濾波片參數(shù)，調(diào)整激光源強度和信號放大器強度，找到高信噪比的參數(shù)集；確定拍攝的最低表面和最高表面，設(shè)置最佳z-軸拍攝間距，進行z-stack掃描拍攝，并收集圖像信息。共聚焦顯微鏡技術(shù)標準：為保證統(tǒng)計數(shù)據(jù)有效性和可重復性，每個樣品須通過隨機采樣法對生物被膜培養(yǎng)區(qū)域拍攝不少于5個視野的生物被膜。觀測前生物被膜須以進行熒光染色，如不經(jīng)染色，則須使用攜帶熒光標記的細菌菌株；熒光染色劑/熒光蛋白標記的熒光信號，須跟所用的激光共聚焦熒光顯微鏡的激光通道相匹配，且進行多熒光通道染色/標記時須避免激發(fā)光/吸收光相近的通道，以免造成誤差；在使用激光共聚焦熒光顯微鏡時，應(yīng)避免載物臺震動引起的誤差；在使用激光共聚焦熒光顯微鏡時，應(yīng)適當調(diào)整激光源能量，較高的能量容易引發(fā)熒光信號猝滅，造成誤差。如需使用熒光探針觀測生物膜，具體參考專利（US10416153B2）。4.2.2生物被膜觀測技術(shù)-電子顯微鏡（SEM）此方法適用于流式培養(yǎng)的生物被膜。準備以下材料：管式培養(yǎng)的生物被膜樣本（參考3.2.1培養(yǎng)方法）；玻片培養(yǎng)生物被膜樣本（參考3.1.3培養(yǎng)方法）操作流程：管式培養(yǎng)的生物被膜：從管式生物被膜系統(tǒng)中將附著有生物被膜的硅膠管小心取出。將附著有生物被膜的培養(yǎng)管用無菌切刀切成0.5mm大小.2.5%戊二醛，乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，并按標準步驟濺射涂金。玻片培養(yǎng)的生物被膜：將載有生物被膜的玻片小心取出，2.5%戊二醛，乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，將玻片切成0.5mm大小，并按標準步驟濺射涂金。電子顯微鏡技術(shù)標準：觀測前生物被膜須以2.5%戊二醛室溫固定1h后，放置于4℃冰箱保存（不要超過1周）；乙醇梯度脫水。樣品先用蒸餾水清洗三次，每次7min，然后依次用50%、70%、85%及95%、100%的乙醇分別處理12min，最后再用無水乙醇處理三次，每次15min。CO2臨界點干燥及噴金操作，按儀器使用說明進行即可。細菌生物被膜耐藥性檢測方法與評定標準5.1細菌生物被膜耐藥性檢測方法-最小抑菌濃度法此方法適用于孔板培養(yǎng)以及玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜。準備以下材料：孔板培養(yǎng)、玻璃珠培養(yǎng)和peglid培養(yǎng)的生物被膜（參考3.1.1、3.1.2和3.1.4培養(yǎng)方法）；所需抗生素（或其他抑菌化合物）；100μL排槍移液器；100μL移液器槍頭；96孔板、24孔板；無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）；無菌LB培養(yǎng)基（或按菌株所需其他培養(yǎng)基）；LB瓊脂板；廢液桶；操作流程：孔板培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，用適當體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過濾膜過濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基）。移除孔板生物被膜中全部上清液，用ddH2O清洗兩次，移除所有廢液。將100uL體積（24孔板生物被膜取1mL）的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個重復，在菌株生長所需溫度下靜置培養(yǎng)16-24小時（可根據(jù)菌株生長或?qū)嶒災(zāi)康倪m當調(diào)整培養(yǎng)時間）。取出孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細菌生長被抑制。移除孔洞內(nèi)菌液，將孔洞中生物被膜用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細菌。之后，按4.1.3a部分CFU計數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細菌CFU數(shù)量，計算抗生素最小抑菌濃度。玻璃珠培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，用適當體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過濾膜過濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基）。將附著有生物被膜的玻璃珠轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，用ddH2O清洗兩次后轉(zhuǎn)移至新的24孔板。將1mL的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個重復，在菌株生長所需溫度下以100rpm轉(zhuǎn)速慢搖培養(yǎng)16-24小時（可根據(jù)菌株生長或?qū)嶒災(zāi)康倪m當調(diào)整培養(yǎng)時間）。取出孔板并將玻璃珠轉(zhuǎn)移至新的24孔板內(nèi)，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細菌生長被抑制。之后，將玻璃珠用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細菌。之后，按4.1.3b部分CFU計數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細菌CFU數(shù)量，計算抗生素最小抑菌濃度。Peglid培養(yǎng)的生物被膜：在無菌操作臺中，用適當體積的LB培養(yǎng)基將所需抗生素溶解至起始濃度為100μμg/mL（可按需調(diào)整起始濃度），用0.2μm過濾膜過濾后，2倍連續(xù)稀釋得到適當體積的50μμg/mL，25μμg/mL，12.5μμg/mL，6.25μμg/mL，3.125μμg/mL，1.562μμg/mL和0μμg/mL（僅培養(yǎng)基），將100μL體積的100μμg/mL至0μμg/mL全部稀釋濃度的抗生素溶液分別添加至孔洞中，每濃度至少3個重復，將附著有生物被膜的peglid小心置入抗生素溶液中，在菌株生長所需溫度下靜置培養(yǎng)16-24小時（可根據(jù)菌株生長或?qū)嶒災(zāi)康倪m當調(diào)整培養(yǎng)時間）。取出peglid，蓋好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm測量孔洞中菌液濃度，OD650nm<0.1代表細菌生長被抑制。同時，將peglid生物被膜用ddH2O清洗兩次，洗脫懸浮細菌。之后，按4.1.3d部分CFU計數(shù)法操作方法，定量抗生素處理后的生物被膜細菌CFU數(shù)量，計算抗生素最小抑菌濃度。最小抑菌濃度法評定要點：所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染;抗生素需按照特性溶解于不同溶液中：如四環(huán)素溶于乙醇中，僅微溶于水等；后稀釋于所需培養(yǎng)基；懸浮細菌須徹底清洗，以免影響最終評測結(jié)果；抗生素起始濃度和加入抗生素后培養(yǎng)時間須按抗生素特性如時間依賴性或濃度依賴性進行適當調(diào)整；最小抑菌濃度須按抑制99.9%的細菌生長為測定標準；生物被膜耐藥程度可以NCCLS/CLSI藥敏試驗標準中的MIC值做參考標準;如需使用群體感應(yīng)抑制劑（Qu