細胞融合實驗報告

細胞融合CellFusionxx201100140120同組者：xx2013年3月14號【實驗?zāi)康摹苛私鈩游锛毎诤系某Ｓ梅椒↙earncommonmethodsofcellfusion學(xué)習(xí)用PEG進行細胞融合的基本操作過程UsePEGtoinducecellfusion注意動物細胞融合的過程中細胞的行為和變化Payattentiontotheactionandchangeofcellsduringtheprocessofcellfusion【實驗原理】細胞融合是指把相同或不同類型的兩個或多個細胞融合成一個具有共同細胞質(zhì)和單一、連續(xù)細胞膜的細胞。Cellfusionisthattwoormorecells，ofsameordifferenttypes，befusedbycertaintechniquetoproduceonecellwithacommoncytoplasmandasinglecontinuouscellmembrane.目前用于細胞融合的有以下三種常用的方法：Virus病毒PEG聚乙二醇Electricshock電擊通過結(jié)合化學(xué)和電擊的方法，可以使細胞融合率高達70%Upto70%cellfusionefficienciesbycombiningbothchemicalandelectricalfusionprotocols.細胞融合率=已融合的細胞核總數(shù)/所有細胞的細胞核總數(shù)*100%Cellfusionefficiencyistheratioofthetotalnumberoffusednucleusoverthatofallthecellsinthevision，usuallyshownaspercentage.除了誘導(dǎo)劑外，其他因素，如細胞類型和性質(zhì)、溫度、PH值、離子強度等也會影響細胞融合率。Inadditiontoinducers，someotherfactors，suchascelltypeandnature，temperature，PHvalue，ionicstrengthetc，willalsoaffecttheefficiencyofcellfusion.聚乙二醇PEG，又名聚環(huán)氧乙烷PEO、聚氧乙烯POE，是一種具有重要商業(yè)價值的聚醚。Poly-ethylene-glycol，alsoknownaspoly-ethylene-oxide、polyoxyethylene，isakindofimportantpolyetherofgreatcommercialvalue.PEG分子能改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，改變接觸處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合，產(chǎn)生體細胞雜合體。PEGmoleculecouldchangethemembranestructureofcellswhichmakesthelipidmoleculedisperseandrecombineatthepointofcontractbetweentwocells.Withthechangeoftheaffinityandthesurfacetensionofthelipidbilayeratthepointofcontract，cellfusionoccurs，producingsomaticcellhybrids.細胞融合技術(shù)的應(yīng)用：applicationofcellfusion生產(chǎn)單克隆抗體productionofmonoclonalantibody基因定位Genemapping繪制人類基因圖譜Human’sgeneticmap原生質(zhì)體新培養(yǎng)體系Newculturesystemforprotoplast培育抗逆植株productionofadverse-resistantplants生物藥品的生產(chǎn)productionofbiologicaldrug為發(fā)酵工程提供優(yōu)良菌種providingstrainsforfermentationindustry【實驗材料】試劑用Alsver液懸浮培養(yǎng)的雞血細胞，0.85%的生理鹽水，GKN溶液，50%PEG溶液儀器和工具蓋玻片、載玻片、離心管、離心機、滴管、顯微鏡等【實驗方法】向1ml血細胞懸液中加入4ml0.85%的生理鹽水，清洗細胞，1000~1200r/min離心5min，棄上清。Add4ml0.85%physiologicalsalineinto1mlbloodcellsuspension，washthoroughlyandcentrifugefor5minutesat1000~1200r/min，discardsupernatant重復(fù)第一步1~2次Repeatstep1onceortwice細胞沉淀中加入GKN溶液至1~2ml，混勻AddGKNsolutionintocellpelletofstep2to1~2mlandmix加0.5ml的混合液到1.5ml的GKN溶液中，充分混勻，紅細胞密度應(yīng)為1.5*107/mlAdd0.5mlmixedsolutioninto1.5mlGKNsolution，mixthemup，andthedensityofRBCinthissuspensionshouldbearound1.5*107/ml取1ml上述紅細胞懸液，加入0.5ml50%PEG溶液，室溫下靜置2~3min，混勻，再進行鏡檢觀察Add0.5ml50%PEGsolutioninto1mlRBCsuspension，incubateatroomtemperaturefor2~3minbeforeobserveundermicroscope【注意事項】制備的雞血紅細胞濃度不能太高，否則細胞容易聚集，影響融合效果。ThedensityofRBCshouldnotbetoohigh，oritwouldbeeasytoleadtothegatheringofcells，whichwouldaffecttheresultofcellfusion.小心仔細，以免出錯Becareful，lestmistakes.溶液的pH值8.0-8.2，可采用緩沖液。溫度為38-40℃。適當?shù)靥岣邷囟瓤梢允辜毎诤系酶浞?，但溫度不能過高，以免細胞膜上的蛋白質(zhì)變性。ThePHvalueofsolutionshouldbe8.0~8.2，wecanusebuffertocontrolit.Thetemperatureshouldbe38~40℃，increasingthetemperatureappropriatelycancontributetoahigherratioofcellfusion，butahightemperaturemayleadtoproteindenaturation.【實驗結(jié)果】圖1未加入PEG時的細胞圖2加入PEG后的細胞（10*40）經(jīng)過PEG的處理，雞血紅細胞中有少部分的細胞發(fā)生了融合，但融合大多是剛剛開始，或兩個細胞細胞質(zhì)膜剛剛接觸，大部分細胞仍呈分散狀態(tài)。其中在視野下還發(fā)現(xiàn)少量細胞聚集成團?！痉治觥坑捎赑EG的加入，使得雞血細胞變形較為嚴重。PEG對細胞融合的作用效果與毒害作用隨著分子量的增加而增大，在實驗過程中一般取其分子量800-6000。若做細胞融合培養(yǎng)實驗則需考慮融合細胞的成活率，故使用分子量不大于1000的PEG溶液；做細胞融合實驗，本次試驗中采用分子量為4000的PEG。本次試驗采用的是雞血細胞，原因是：雞血細胞具有細胞核，便于對發(fā)生融合的細胞進行鑒別，細胞內(nèi)只有一個細胞核，則為未融合的細胞，若有多個細胞核，則為發(fā)生了融合的細胞；實驗材料便宜易得。PEG處理時間，應(yīng)控制在1~2min，盡管PEG處理的時間越長，細胞融合越多，但對細胞的毒害也越大。實驗中兩次離心是為了清洗細胞表面，增大細胞接觸面積，有利于細胞間的融合。因此，每一步離心前都要將樣品小心吹打混勻，反之，視野下有可能出現(xiàn)聚集成團的細胞。在加入PEG時，要緩慢沿著管壁加入，同時避免振動。化學(xué)誘導(dǎo)融合，操作簡便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，且效果比較穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對于細胞具有一定的毒性?！舅伎碱}】細胞融合理論和實際意義在理論上，細胞融合能把親緣關(guān)系較遠，甚至毫無親緣關(guān)系的生物體細