聚合酶鏈式反應實驗方法

聚合酶鏈式反應(PCR)實驗方法聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93°C-94°C)使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核甘酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補結(jié)合，兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72C將單核甘酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’一3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核甘酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；由少量mRNA生成cDNA文庫；從cDNA中克隆某些基因；生成大量DNA以進行序列測定；突變的分析；染色體步移；RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。一、 試劑準備DNA模版對應目的基因的特異引物10xPCRBuffer2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mMTaq酶二、 操作步驟在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。TOC\o"1-5"\h\z10xPCRbuffer 5/dNTPmix(2mM) 4引物1(10pM) 2/引物2(10pM)Taq酶（2U/W）DNA模板（50ng-1pg/pl） 1pl加ddH2O至 50pl視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93°C預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93C40s一58C30s一72C60s，循環(huán)30-35次，最后在72C保溫7min。結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4C待電泳檢測或-20C長期保存。PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100pl氯仿進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10pl電泳檢測。三、PCR反應體系的組成與反應條件的優(yōu)化PCR反應體系由反應緩沖液（10>PCRBuffer）、脫氧核甘三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核甘酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。反應緩沖液：一般隨TaqDNA聚合酶供應。標準緩沖液含：50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室溫），1.5mMMgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核甘酸濃度為200pM時，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應時，也必須相應調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好。dNTP:高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400pM的dNTP。四種脫氧三磷酸核甘酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應中起重要作用的Mg2+濃度。TaqDNA聚合酶酶：在100pl反應體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達到每min延伸1000-4000個核甘酸的摻入速度。酶量過多將導致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應影響極大，因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如20pl或50pl），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應效率將降低。引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：⑴引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55C[Tm=4（G+C）+2（A+T）]。應盡量避免數(shù)個嘌吟或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應表現(xiàn)出是隨機的。⑵引物的3’端不應與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在T端不應出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機輔助設(shè)計。⑶人工合成的寡聚核甘酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進行純化。⑷引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer）,二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟，而且反應特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/W較好。⑸引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100pM），保存于-20°C。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10^M或20^M的工作液。模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應的特異性，一般還宜用四水平的基因組DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應。PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復性、延伸的時間，可增加產(chǎn)物的特異性。四、注意事項PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。最好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。PCR試劑配制應使