載銀二氧化鈦納米管陣列涂層的制備及其細(xì)胞毒性

載銀二氧化鈦納米管陣列涂層的制備及其細(xì)胞毒性

目前，植物修復(fù)廣泛應(yīng)用于口腔無(wú)牙患者的治療中，但大部分植物體通常因感染而失敗。這可能是由于目前大量應(yīng)用的純鈦種植體在穿齦部分不像自然牙那樣能與周圍軟組織形成致密的生物學(xué)結(jié)合,而純鈦又不具備抗菌活性,從而導(dǎo)致病菌易侵入深部造成感染。陽(yáng)極氧化作為一種新型表面處理技術(shù),可在純鈦表面生成垂直排布的TiO2納米管陣列(TiO2nanotubearray)。該管狀陣列結(jié)構(gòu)擁有比純鈦更大的比表面積和生物活性,可以影響細(xì)胞黏附、增殖、分化、基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能.在不同的管徑下,TiO2納米管陣列對(duì)不同種類的細(xì)胞所起的影響不一樣。有研究表明:管徑約120nm的TiO2納米管結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、增殖等功能,而且在人工唾液中表現(xiàn)出良好的電化學(xué)穩(wěn)定性,可以促進(jìn)口腔種植體與周圍牙齦組織結(jié)合。此外,TiO2納米管陣列可以提供吸附容納抗菌因子所需的空間結(jié)構(gòu)。在金屬元素中,由于銀具有強(qiáng)大的多層次多途徑抗菌活性,所以相對(duì)于抗生素,細(xì)菌很少對(duì)銀產(chǎn)生耐藥性,這也提示銀有可能作為一種抗菌活性因子應(yīng)用于口腔種植體表面。Das等利用電沉積法將直徑1~2μm的銀顆粒黏附于TiO2納米管陣列表面,該載銀納米管陣列不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,同時(shí)對(duì)綠膿桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)大的抵抗力。銀的物理化學(xué)性質(zhì)影響其抗菌性和毒性,有文獻(xiàn)報(bào)道:細(xì)菌對(duì)直徑小于10nm的單質(zhì)銀顆粒表現(xiàn)出較高的毒性反應(yīng),而這種銀粒子對(duì)真核細(xì)胞表達(dá)較低的毒性。但盡管如此,納米級(jí)載銀涂層若要作為抗菌改性方法應(yīng)用于口腔種植體表面,其細(xì)胞毒性仍然需要進(jìn)一步研究。本研究旨在通過(guò)電沉積法制備載銀TiO2納米管陣列表面涂層,使用X射線光電子能譜(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)與場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡(Fe-sem)觀察分析該涂層表面元素構(gòu)成和微形貌,并通過(guò)小鼠L-929細(xì)胞培養(yǎng)和MTT法檢測(cè)涂層的細(xì)胞毒性。為該載銀納米管陣列涂層應(yīng)用于臨床口腔種植體表面提供生物學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1細(xì)胞系和儀器醫(yī)用純鈦板材(99.9%,西北有色金屬研究院);直流穩(wěn)壓電源、鉑電極(香港龍威有限公司);AgNO3、DMSO、苯酚(Sigma,美國(guó));96孔培養(yǎng)板(Costar,美國(guó));L-929細(xì)胞系(第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心);DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、新生牛血清(Gibco,美國(guó));青霉素、鏈霉素(Roche,美國(guó));MTT(Amresco,美國(guó));CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó));倒置顯微鏡(Olympus,日本);自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio-tek,美國(guó));AxisUltra型X射線光電子能譜儀(Kratos,英國(guó));Jsm-6460型場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡(JEOL,日本)。1.2試件的制備將醫(yī)用純鈦切割成10mm×10mm×0.6mm的試件,每個(gè)試件分別使用400~1500目碳化硅砂紙進(jìn)行序列打磨拋光后,依次用丙酮、950mL/L乙醇及雙蒸水進(jìn)行10min超聲清洗,自然干燥后備用。1.3表面處理和載銀處理取上述拋光處理后的純鈦試件45枚,隨機(jī)分為純鈦拋光組P、TiO2納米管組(NT)和載銀納米管組(NAg),每組15枚。將NT組和NAg組試件放入含0.5%NH4F、1mol/L(NH4)2SO4的陽(yáng)極氧化電解液中,以試件為陽(yáng)極,鉑為陰極,在電壓20V、電流0.18A及持續(xù)攪拌的條件下進(jìn)行45min的處理,使純鈦表面形成TiO2納米管陣列。上述處理完成后的試件在N2中干燥后,再將NAg組試件放于濃度為0.03mol/L的硝酸銀液中,在電壓2V、電流100mA、時(shí)間30s并持續(xù)攪拌的條件下進(jìn)行電沉積法載銀處理。完成后的試件迅速浸入雙蒸水中進(jìn)行超聲清洗,以去除未緊密黏附的銀粒子并在N2中干燥后備用。1.4試件表面電子顯微鏡分析于每組試件中各隨機(jī)抽取3枚試件,每個(gè)試件依次用丙酮、950mL/L乙醇、雙蒸水中進(jìn)行10min超聲清洗后,真空干燥,利用X射線光電子能譜、場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡分析試件表面元素構(gòu)成和微形貌。1.5表面改造后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)根據(jù)ISO10993-5規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)使用MTT法觀察載銀納米管陣列涂層浸提液對(duì)小鼠L-929細(xì)胞增殖的影響,并評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性。1.5.1dmem培養(yǎng)牛細(xì)胞層取凍存復(fù)蘇的L-929細(xì)胞接種于250mL培養(yǎng)瓶中,加入含新生牛血清100mL/L、青霉素(鏈霉素)10g/L的DMEM培養(yǎng)液(pH=7.4),在37℃、50mL/LCO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞層生長(zhǎng)至70%~80%時(shí)進(jìn)行傳代。1.5.2dmem浸提液制備將P、NT、NAg、氧化鋁陶瓷(用于毒性陰性對(duì)照)試件分別以1mL/Lcm2(培養(yǎng)液體積/試件面積)比例浸沒(méi)于DMEM培養(yǎng)液中,50℃下浸提72h,所得浸提液過(guò)濾除菌后備用。1.5.3dmem培養(yǎng)液制備取第4代L-929細(xì)胞用2.5g/L胰酶消化,重懸于DMEM培養(yǎng)液中,調(diào)細(xì)胞濃度為1×104/mL,以每孔100μL接種于96孔板。37℃培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液并隨機(jī)分為6組,分別加入P、NT、NAg、氧化鋁陶瓷浸提液及含苯酚70g/L的DMEM培養(yǎng)液(用于毒性陽(yáng)性對(duì)照)和純DMEM培養(yǎng)液(空白對(duì)照),每組復(fù)27孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并照相。然后在24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),棄培養(yǎng)液,加入20μLMTT液(5mg/mL)和80μLDMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h以形成甲臜結(jié)晶。棄液,每孔加入200μLDMSO室溫微量震蕩10min溶解結(jié)晶物。使用酶標(biāo)儀在570nm(650nm參考波長(zhǎng))波長(zhǎng)下測(cè)定每孔光密度值(ODvalue),取均值,通過(guò)下列公式計(jì)算L-929細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)。RGR(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值空白對(duì)照組OD值×100%RGR(%)=實(shí)驗(yàn)組ΟD值空白對(duì)照組ΟD值×100%RGR越低,則潛在的細(xì)胞毒性越高,當(dāng)<70%時(shí),該材料被認(rèn)為具有明顯的細(xì)胞毒性。1.6統(tǒng)計(jì)分析利用Excel2003及SPSS18.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析,兩兩比較用SNK-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。2結(jié)果2.1納米管陣列表面XPS結(jié)果顯示:純鈦、TiO2納米管陣列涂層(圖1a、b)主要由鈦(Ti)和氧元素(O)構(gòu)成,并有少量有機(jī)物污染(N,C,S)。載銀TiO2納米管陣列表面(圖1c)探測(cè)到高強(qiáng)度銀元素能量峰,表明NAg組試件表面確實(shí)含有銀元素成分。應(yīng)用俄歇電子能譜(AES)對(duì)NAg組進(jìn)一步分析,校正計(jì)算AgM4VV峰值可證明該試件表面的銀以單質(zhì)形態(tài)存在并表現(xiàn)為0價(jià)態(tài)。2.2純鈦試件的電沉積載銀性能利用Fe-sem對(duì)2種納米管陣列進(jìn)行觀察分析發(fā)現(xiàn):拋光鈦表面無(wú)特殊結(jié)構(gòu)(圖2a)。經(jīng)陽(yáng)極氧化處理后,純鈦試件表面形成了一層由垂直管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成的陣列,其管徑約為80~120nm(圖2b)。在此基礎(chǔ)上經(jīng)電沉積載銀處理后,可觀察到大量均勻分布在納米管壁上的高亮顆粒,其直徑約為10nm(圖2c、d)。結(jié)合XPS分析可確定該高亮顆粒為納米級(jí)銀粒子。2.3銀納米管表面涂層細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)2.3.1大量細(xì)胞漂浮培養(yǎng)24h后,陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生變形、皺縮及體積減小,大量細(xì)胞壞死漂浮(圖3a)。而P、NT、NAg、陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞邊緣清晰折光良好、呈標(biāo)準(zhǔn)多角形,細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,細(xì)胞密度高并連接成片(圖3b-f)。2.3.2陽(yáng)性對(duì)照組與其他實(shí)驗(yàn)組od值對(duì)比P、NT、NAg、陰性對(duì)照各組的OD值在24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異(P>0.01)。而陽(yáng)性對(duì)照組在所有時(shí)間點(diǎn)的OD值均遠(yuǎn)低于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)(圖4)。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率結(jié)果對(duì)各材料毒性評(píng)估發(fā)現(xiàn):除陽(yáng)性對(duì)照組外,其他各組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對(duì)增值率均在80%以上,未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性(表1)。3納米管陣列的細(xì)胞毒性分析目前口腔種植體表面改性方法很多,陽(yáng)極氧化技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單,所形成的納米管管徑可調(diào)節(jié),成膜效果穩(wěn)定、高度的生物活性等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注。大量研究表明:不同細(xì)胞對(duì)不同管徑的納米管陣列表現(xiàn)出多樣的生物活性反應(yīng)[5,6,8,17,18,19,20,21,22,23],應(yīng)用納米管陣列表面處理不但有可能促進(jìn)口腔種植體穿齦部與周圍軟組織的結(jié)合也有利于抗菌因子的加載。銀作為古老的抗菌材料早已應(yīng)用于很多領(lǐng)域,學(xué)者們應(yīng)用多種方法將銀加載于納米管上,并進(jìn)行了大量的生物學(xué)研究,但均沒(méi)有對(duì)載銀的條件、效果以及載銀后的表面涂層的細(xì)胞毒性進(jìn)行系統(tǒng)地評(píng)價(jià)。本研究著眼于設(shè)計(jì)一種均勻載銀的TiO2納米管陣列涂層,使其具備良好的細(xì)胞生物安全性并有可能賦予口腔種植體穿齦部抗菌性能。納米管陣列表面利用電沉積法載銀依賴4個(gè)條件:電壓、電流、時(shí)間、AgNO3溶液的濃度。在我們先前的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):4個(gè)條件中任意一個(gè)偏高都會(huì)導(dǎo)致納米管陣列表面沉積的銀顆粒大小不均結(jié)合疏散。所以本研究中選用了低電壓、低電流、短時(shí)間、極低濃度電解液的方法。銀的存在狀態(tài)決定了其毒性,離子狀態(tài)下的銀毒性較大,可促使產(chǎn)生活性氧簇(ROS)從而損傷細(xì)胞。本研究通過(guò)X射線光電子能譜儀和場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡觀察到在納米管陣列表面加載了大量均勻分布的銀顆粒,直徑約為10nm,并通過(guò)AES證實(shí)了TiO2納米管陣列表面加載的納米銀顆粒均為0價(jià)的單質(zhì)銀,雖然單質(zhì)銀顆粒在液體中也能釋放出少量的銀離子,但有研究表明由納米級(jí)單質(zhì)銀顆粒釋放的痕量銀離子并不會(huì)導(dǎo)致明顯的細(xì)胞毒性。這也為本研究中制備的載銀納米管陣列涂層具備良好的細(xì)胞安全性提供了理論依據(jù)。目前評(píng)價(jià)生物材料毒性的方法眾多,其中最常用的是體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。本研究選用了ISO10993-5標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法嚴(yán)格進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用MTT法反映細(xì)胞增殖活力,并由此對(duì)該載銀納米管涂層的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明該涂層在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,這也印證了先前的報(bào)道。同時(shí)在細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察中也未能發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)變化