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糖含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案還原糖濃度測(cè)定簡(jiǎn)介還原糖是指含有自由醛基和酮基、具有還原性的糖類。黃色的3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑與還原糖在堿性條件下共熱后,自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),反應(yīng)液里棕紅色的深淺與還原糖的含量成正比,在波長(zhǎng)為540nm處測(cè)定溶液的吸光度,查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算,便可求得樣品中還原糖的含量。不具還原性的部分雙糖或多糖經(jīng)酸水解后可徹底分解為具有還原性的單糖。通過(guò)對(duì)樣品中的總糖進(jìn)行酸水解,測(cè)定水解后還原糖含量,可計(jì)算出樣品的含量。由于多糖水解為單糖時(shí),每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水,所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以系數(shù)0.9。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑設(shè)備:分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、試管及試管架、容量瓶、移液器、量筒。試劑:1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取80°C烘至恒重的分析純葡萄糖100mg,置于小燒杯中,加少量蒸餾水溶解后,轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中,用蒸餾水定容至100ml,混勻,4C冰箱中保存?zhèn)溆谩NS試劑(3,5-二硝基水楊酸)稱取3,5—二硝基水楊酸(10土0.1)g,置于約600mL水中,逐漸加入氫氧化鈉10g,在50C水浴中(磁力)攪拌溶解,再依次加入酒石酸甲鈉200g、苯酚(重蒸)2g和無(wú)水亞硫酸鈉5g,待全部溶解并澄清后,冷卻至室溫,用水定容至1000mL,過(guò)濾。貯存于棕色試劑瓶中,于暗處放置7d后使用。操作方法(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取9支干凈試管編號(hào),按表1加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水

和DNS試劑,配成不同濃度的葡萄糖反應(yīng)液。表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試劑012345678葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)21.81.61.41.21.00.80.60.4DNS(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6OD540將以上溶液,封口置沸水浴煮5min,冷浴冷卻,定容至25mL,以0號(hào)管為對(duì)照,在540nm下測(cè)定吸光值,以葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo),吸光度為橫坐標(biāo),擬合曲線。(2)樣品中還原糖測(cè)定①樣品中還原糖的提取:準(zhǔn)確稱取1.00g樣品,放入100ml燒杯中,先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀,然后補(bǔ)足至50ml蒸餾水,攪勻,煮沸5min,是還原糖浸出。將浸出液(含沉淀)轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,于4000r/min離心5min,沉淀可用20ml蒸餾水洗一次,再離心,將兩次離心的上清液收集在100ml容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻,即為稀釋100倍的還原糖待測(cè)液(實(shí)際操作時(shí)可根據(jù)需要稀釋至適當(dāng)倍數(shù):10、20、30、40、50、100、200等)。表2樣品還原糖測(cè)定試劑0123樣品溶液(ml)01.01.01.0蒸餾水(ml)2.01.01.01.0DNS(ml)1.51.51.51.5OD540通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的還原糖量(mg)樣品中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)

②還原糖的測(cè)定:取4支試管,編號(hào)0、1、2、3.以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法,在1-3號(hào)試管分別加入1ml待測(cè)液和1ml蒸餾水,1.5mlDNS(保證與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同的反應(yīng)體系),而對(duì)照的0號(hào)管內(nèi)則加2ml的蒸餾水和1.5mlDNS.封口置沸水浴煮5min,冷浴冷卻,定容至25ml.在540nm下測(cè)吸光度。結(jié)果計(jì)算計(jì)算光密度的平均值,根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到還原糖的質(zhì)量C,按下列計(jì)算樣品還原糖和總糖的含量。o=C^x100m計(jì)算公式由公式:還原糖(%)還原糖(%)=查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)x提取液總體積/測(cè)定時(shí)所取用體積

樣品毫克數(shù)x100整理所得。式中,①一還原糖(以葡萄糖計(jì))的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;C一還原糖或總糖提取液濃度,mg/ml,本公式中C即為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的還原糖毫克數(shù)(測(cè)定時(shí)取用體積為1ml);V一提取液的總體積,ml(提取液的總體積即為稀釋倍數(shù));M一樣品質(zhì)量,mg。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)樣品的稀釋倍數(shù)要保證計(jì)算得到的葡萄糖濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好范圍內(nèi)。以往經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道表明,OD540在0.1-0.4范圍內(nèi)數(shù)據(jù)較為真實(shí)。總糖濃度測(cè)定簡(jiǎn)介糖類在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫水生成糠醛或羥甲基糖醛后,與蒽酮(C14H10O)脫水縮合,形成糠醛的衍生物,呈藍(lán)綠色。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收,在150pg/ml范圍內(nèi),其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度,糖含量在30pg左右就能進(jìn)行測(cè)定,所以可做為微量測(cè)糖之用。一般樣品少的情況下,采用這一方法比較合適。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑儀器:電熱恒溫水浴鍋,分光光度計(jì),電子天平,容量瓶,刻度吸管等試劑:(1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:100pg/ml(2) 濃硫酸、濃鹽酸(3) 蒽酮試劑:0.2g蒽酮溶于100ml濃H2SO4中。當(dāng)日配制使用。操作方式(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取7支試管,按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液:管號(hào)1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.10.20.30.40.50.6蒸餾水(ml)10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量(“g0102030406080在每支試管中立即加入蒽酮試劑4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷卻,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加蓋,以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起,準(zhǔn)確煮沸10min取出,用冰浴冷卻至室溫,在620nm波長(zhǎng)下以第一管為空白,迅速測(cè)其余各管吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量(pg)為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) 總糖的提取:精確稱取0.5g,置于50ml三角瓶中,加水15m1,濃鹽酸10ml,沸水浴20min,定容至100ml,得提取液。取10ml濾液定容至100ml。(3) 測(cè)定吸取1ml已稀釋的提取液于試管中,加入4.Oml蒽酮試劑,平行三份;空白管以等量蒸餾水取代提取液。以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)A620平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡

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