氧自由基與細(xì)胞間粘附分子-1在老年大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)的變化

氧自由基與細(xì)胞間粘附分子-1在老年大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)的變化

在舊時(shí)期，由于重新注入心肌缺血（i級(jí)）的損傷，死亡的壓力比年輕時(shí)明顯，其確切機(jī)制尚不清楚。在以往的研究中，明確發(fā)現(xiàn)氧自由基（o3）和細(xì)胞間粘附在-1（icam-1）中的氧自由基參與心肌疾病的預(yù)防和。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用青、老年大鼠心肌IRI模型,觀察心肌缺血再灌注時(shí)ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)及其與超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(PMNs)、心肌梗死面積的關(guān)系,探討老年大鼠心肌IRI的機(jī)制。1材料和方法1.1心肌缺血再灌注損傷模型依據(jù)Wistar大鼠正常壽命范圍,將2月齡Wistar大鼠36只,體重250～300g,設(shè)為青年組(YIR組);2年齡Wistar大鼠36只,體重400～450克,設(shè)為老年組(OIR組),雌雄不拘,兩組均先缺血60分鐘,然后隨機(jī)分設(shè)再灌注3、6、12、24小時(shí)共4個(gè)時(shí)相點(diǎn);心肌缺血再灌注損傷模型參照方喜業(yè)方法加以改進(jìn),以收緊結(jié)扎線后心電圖Ⅰ或左前胸導(dǎo)聯(lián)融合的ST-T抬高,放松后抬高的ST-T下降1/2以上為造模成功。對(duì)照組只埋線不結(jié)扎。于各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)活殺動(dòng)物取心臟缺血區(qū)的心肌測(cè)定各時(shí)相點(diǎn)ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)、SOD、MDA、PMNs4個(gè)指標(biāo)。對(duì)照組只埋線不結(jié)扎,選12小時(shí)時(shí)相點(diǎn)作為總體對(duì)照。另用青、老年大鼠各25只,分組方式同上,每組5只,測(cè)定心肌梗死范圍。1.2化學(xué)、化學(xué)、sod、mda測(cè)試ICAM-1單克隆抗體(美國(guó)R&D公司),SP免疫組織化學(xué)測(cè)試藥盒(福州邁新公司),HTAB、O-dianisidine,TTC,(Sigma公司),SOD、MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所);其余試劑均為分析純級(jí)。1.3檢測(cè)方法1.3.1ic-1的蛋白質(zhì)含量為取待測(cè)心肌冰凍切片用SP免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定,DAB顯色;結(jié)果用CMIAS007計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)圖像分析儀處理,單位以面密度表示。1.3.2測(cè)定心肌中粒浸潤(rùn)參照Bradley等建立的髓過(guò)氧化物酶(MPO)法測(cè)定心肌中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量。1.3.3dap和sod測(cè)試按常規(guī)制作心肌組織勻漿。心肌組織MDA用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定,心肌組織SOD活性測(cè)定用黃嘌呤過(guò)氧化物酶法。1.3.4測(cè)定脈搏面積用TTC染色法測(cè)定,以梗死心肌與左室重量的百分比表示梗死范圍。1.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)資料以(ˉxxˉ±s)表示,采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析,t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1青、老年組蛋白表達(dá)水平青、老年組大鼠心肌IR時(shí),ICAM-1蛋白表達(dá)均明顯增高,在缺血1小時(shí)時(shí),其表達(dá)已有增高,再灌注后改變更加顯著,至再灌注12～24小時(shí)達(dá)高峰;青、老年組高峰期表達(dá)分別較對(duì)照組增高189.5倍和244.7倍,P均<0.01;青年組于再灌注12小時(shí)后其蛋白表達(dá)基本維持在同一水平,而老年組仍有持續(xù)緩慢增高的趨勢(shì)。青、老年組各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)ICAM-1蛋白含量間差別均有顯著性意義(均P<0.05,見(jiàn)表1、表6、表7)。2.2青、老年組灌注前后灌注后變化青、老年組大鼠心肌缺血1小時(shí)時(shí),其PMNs浸潤(rùn)數(shù)已有明顯增高,再灌注后改變更加顯著,至再灌注12小時(shí)后增加的速率有所減緩,但至24小時(shí)仍未見(jiàn)下降;青、老年組各時(shí)相點(diǎn)較對(duì)照組明顯增高,均P<0.05～0.01;老年組與青年組各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)之間比較,除I1小時(shí)一個(gè)時(shí)相點(diǎn)外,其余各時(shí)相點(diǎn)的PMNs浸潤(rùn)數(shù)間的差別均有顯著性意義(均P<0.05,見(jiàn)表2、表6、表7)。2.3青、老年組各時(shí)相點(diǎn)比較青、老年組大鼠于心肌缺血1小時(shí)MDA已明顯增加,再灌注后改變更加顯著,至再灌注6小時(shí)達(dá)峰值后逐漸下降;青、老年組各時(shí)相點(diǎn)較對(duì)照組明顯增高(P均<0.05);老年組與青年組各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)之間比較,除I1小時(shí)時(shí)相點(diǎn)外,其余各時(shí)相點(diǎn)的MDA含量間的差別均有顯著性意義(P均<0.05,見(jiàn)表3、表6、表7)。2.40.05青、老年組大鼠于心肌缺血1小時(shí)時(shí)SOD即已明顯降低,至再灌注6小時(shí)達(dá)低谷,以后逐漸回升(P均<0.05);老年組與青年組各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)之間比較,只有在IR12小時(shí)時(shí)相點(diǎn)心肌SOD活性間的差別有顯著性意義(P<0.01,表4、表6、表7)。2.5控制自己爾氏紅色的下降的趨勢(shì)心肌缺血再灌注后,老年組與青年組心肌梗死范圍均呈逐步增高的趨勢(shì),這種改變?cè)谠俟嘧?2小時(shí)后趨緩。老年組與青年組各相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)之間比較,心肌梗死范圍間的差別均有顯著性意義(均P<0.05,見(jiàn)表5、表6、表7)。3血清蛋白及血清其他指標(biāo)變化老年期機(jī)體對(duì)心肌缺血再灌注損傷的敏感性較青年期明顯增高,這是造成老年人心肌梗死的預(yù)后較青年人差的主要原因之一,但其確切機(jī)制仍不清楚。Gao等發(fā)現(xiàn)心肌IR時(shí),ICAM-1介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞(polymorphonuclearneutrophilsPMNs)對(duì)組織細(xì)胞的粘附、浸潤(rùn)和IRI的發(fā)生、發(fā)展;可通過(guò)抑制ICAM-1的表達(dá)而減輕IRI,時(shí)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。ICAM-1介導(dǎo)PMNs浸潤(rùn)激活是氧自由基的主要來(lái)源,也是細(xì)胞損傷的主要原因。但I(xiàn)CAM-1不是始動(dòng)因素,那么,在IR后變化更早的OFR在青、老年階段有無(wú)差異,這種差異是否對(duì)ICAM-1產(chǎn)生影響及其是否是老年期對(duì)IRI敏感性增高的原因尚不清楚,本研究顯示:在缺血再灌注后各時(shí)相點(diǎn)老年大鼠ICAM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、PMNs浸潤(rùn)數(shù)、MDA含量、心肌梗死范圍均較青年組明顯增高,SOD較青年組明顯降低,但MDA、SOD達(dá)峰、谷值的時(shí)間早于ICAM-1表達(dá)及PMNs浸潤(rùn)的峰值。Telek等在一組急性炎癥研究中發(fā)現(xiàn)OFR早期即增高,并可使ICAM-1表達(dá)上調(diào),上調(diào)的ICAM-1又使PMN激活,這是OFR的主要來(lái)源。本試驗(yàn)也提示IR時(shí)OFR的增加可促進(jìn)ICAM-1的表達(dá),而ICAM-1高表達(dá)導(dǎo)致PMNs浸潤(rùn)增加,PMNs粘附血管內(nèi)皮并遷移至缺血心肌組織產(chǎn)生大量的OFR,損傷心肌細(xì)胞。這種變化在老年大鼠IR