聚乙烯100硬脂基醚修飾長循環(huán)葡胺脂質(zhì)體的制備及體外評價

聚乙烯100硬脂基醚修飾長循環(huán)葡胺脂質(zhì)體的制備及體外評價

d-los-32（mg-tpa）是一種廣泛使用的臨床磁共振成像儀（mri）的造影劑。具有低毒性和高自旋次數(shù)（7.2），可以顯著改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊柱的形成效果。但普通的釓噴酸葡胺制劑在體內(nèi)代謝較快,維持時間較短,限制了其使用。筆者制備了釓噴酸葡胺脂質(zhì)體,再用聚乙烯100硬脂基醚(Brij700)修飾制得長循環(huán)脂質(zhì)體,旨在達(dá)到長效目的。但被Brij700修飾的脂質(zhì)體能否被腫瘤細(xì)胞吞噬呢?因此,筆者在本研究中對釓噴酸葡胺普通脂質(zhì)體和長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及被腫瘤細(xì)胞攝取的情況進(jìn)行了初步研究。1儀器、試藥與儀器釓噴酸葡胺注射液(北京北陸藥業(yè)股份有限公司,批號:06080221,規(guī)格:5.57g·15mL-1);注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司,批號:060705);Brij700(美國Sigma公司);DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)。前列腺癌(PC3)細(xì)胞株由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院培養(yǎng)。高效液相色譜儀(日本島津公司);掃描電子顯微鏡(美國EPAX公司);電子天平(德國Sartorius公司);TE300型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);nicomp380zls-zeta電位/超細(xì)微粒粒度分析儀(美國PSS公司)。2方法和結(jié)果2.1油包水型乳劑的制備采用逆相蒸發(fā)法制備。將磷脂、膽固醇按一定比例溶于氯仿,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于25℃減壓蒸發(fā)除去氯仿,在瓶壁內(nèi)形成薄膜,再加入氯仿溶解脂質(zhì)薄膜后,加入適量釓噴酸葡胺注射液,超聲至混合物形成均勻的油包水型乳劑,再在一定溫度下減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,充氮?dú)?4℃保存。2.2脂質(zhì)體長循環(huán)制備采用逆相蒸發(fā)法制備。將磷脂、膽固醇、Brij700按一定比例溶于氯仿,然后同“2.1”項下普通脂質(zhì)體的制備方法。2.3形態(tài)觀察和粒度分析分別取2種脂質(zhì)體懸液數(shù)滴,加適量磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋,分別用掃描電鏡觀察形態(tài),結(jié)果見圖1;再用電位/超細(xì)微粒粒度分析儀測定其粒度及分布,結(jié)果見圖2。由圖1可見,2種脂質(zhì)體形態(tài)圓整。由圖2可見,普通脂質(zhì)體的粒徑平均為824.0nm,長循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑平均為362.7nm,2種脂質(zhì)體粒徑均分布集中。2.4方法的線性范圍、重復(fù)性、回收率、包封率試驗2.4.1色譜條件。色譜柱:HypersilC8(250mm×4.6mm,5μm);流動相:水-乙腈-四丁基高氯酸銨(700mL∶300mL∶1.7g);流速:1.0mL·min-1;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;檢測波長:195nm。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的考察。以水為溶劑制備濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6mmol·L-1的釓噴酸葡胺系列濃度溶液,分別取20μL進(jìn)樣。以濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸,得方程y=135057x+4153.8(r=0.9998)。結(jié)果,釓噴酸葡胺檢測濃度線性范圍為1.6×10~6.0×10mol·L。2.4.3精密度試驗。制備濃度為0.03、0.1、0.4mmol·L-1的釓噴酸葡胺溶液各5份,進(jìn)樣測定;另取0.4mmol·L-1的釓噴酸葡胺溶液連續(xù)5d分別進(jìn)樣測定,計算日內(nèi)、日間RSD。結(jié)果分別為2.77%、2.42%、1.86%和3.14%、1.56%、1.62%。2.4.4回收率試驗。按相關(guān)方法進(jìn)行回收率試驗。結(jié)果,其低、中、高濃度的回收率分別為97.5%、97.3%、99.92%(n=3)。2.4.5脂質(zhì)體包封率測定。采用透析法測定包封率。精密量取長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液5mL,置于適當(dāng)長度的透析袋中,兩端扎緊,置于200mLPBS中,4℃放置12h,換液繼續(xù)放置12h,收集透析液,進(jìn)樣測定并計算透析液中藥物的濃度及包封率。包封率=(1—游離藥物質(zhì)量/藥物總質(zhì)量)×100%。結(jié)果,普通脂質(zhì)體的包封率為63.16%,長循環(huán)脂質(zhì)體的包封率為61.15%。2.5噴酸葡胺細(xì)胞的體外分離和測定取PC3細(xì)胞接種于25mL的培養(yǎng)瓶中。DMEM培養(yǎng)基中含1%非必需氨基酸和10%胎牛血清;細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳,相對濕度90%。取傳代后2d的細(xì)胞12瓶,隨機(jī)分為4組,每組3瓶,移去營養(yǎng)液,分別加入PBS作為空白對照組以及釓濃度均為20mmol·L-1的釓噴酸葡胺注射液、普通脂質(zhì)體、長循環(huán)脂質(zhì)體,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,移去脂質(zhì)體,PBS連續(xù)洗3遍,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,用胰酶消化,移入離心管中,計數(shù),離心,PBS連續(xù)洗2遍,以MRI檢測SE-T1W信號值,其值與細(xì)胞中攝取的釓噴酸葡胺的濃度成正比。每組試驗最后收集到的細(xì)胞數(shù)分別為空白對照組1.60×106個、釓噴酸葡胺注射液組1.60×106個、普通脂質(zhì)體組1.70×106個、長循環(huán)脂質(zhì)體組1.50×106個。PC3細(xì)胞對2種脂質(zhì)體攝取后SE-T1W信號值分別為普通脂質(zhì)體362、長循環(huán)脂質(zhì)體299。由MRI檢測結(jié)果和最后收集的細(xì)胞數(shù)量,得到平均每個細(xì)胞攝取釓噴酸葡胺的量:普通脂質(zhì)體2.12×10-4、長循環(huán)脂質(zhì)體2.70×10-4,從而說明PC3細(xì)胞對釓噴酸葡胺長循環(huán)脂質(zhì)體的攝取大于普通脂質(zhì)體。MRI檢測結(jié)果見圖3。3brij沿線脂質(zhì)體在腫瘤細(xì)胞治療的修飾脂質(zhì)體廣泛地用于包封抗腫瘤藥物,使用可長循環(huán)的化合物用于修飾脂質(zhì)體,可使其避免被巨噬細(xì)胞吞噬,從而使脂質(zhì)體到達(dá)