T-CACM 1027.201-2021 當(dāng)歸配方顆粒PCR鑒別

ICS

11.020CCS

C

10 T/CACM

—2021當(dāng)歸配方顆粒

PCR

鑒別PCR

identification

of

Danggui

peifangkeli

發(fā)布

實施中

華

中

醫(yī)

藥

學(xué)

會

發(fā)

布T/CACM

1027.201—2021 前言

................................................................................

II1

..............................................................................

12

規(guī)范性引用文件

....................................................................

13

術(shù)語和定義

........................................................................

14

..........................................................................

15

..........................................................................

16

......................................................................

17

..........................................................................

27.1 基本要求

......................................................................

27.2 取樣

..........................................................................

27.3

提取

.......................................................................

27.4

擴(kuò)增

.......................................................................

27.5 限制性內(nèi)切酶酶切

..............................................................

37.6 擴(kuò)增/酶切產(chǎn)物檢測

.............................................................

38

..........................................................................

39

..........................................................................

39.1 一般要求

......................................................................

39.2 檢測報告

......................................................................

310

.........................................................................

411 廢棄物處理

.......................................................................

4附錄

A（規(guī)范性）

檢測用儀器設(shè)備和試劑試藥.............................................

5附錄

B（資料性）

當(dāng)歸配方顆粒

PCR

......................................

7參考文獻(xiàn)

............................................................................

11T/CACM

1027.201—2021 本文件按照GB/T

—

《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心提出。本文件由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。本文件起草單位：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、安徽省食品藥品檢驗研究院、浙江省中醫(yī)院、成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司、華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司。IIT/CACM

1027.201—2021

PCR

1 范圍本文件規(guī)定了使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒別當(dāng)歸配方顆粒的通用方法和要求。本文件適用于當(dāng)歸配方顆粒的鑒別。本文件不適用于正偽混合樣品的鑒定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T

27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測T/CACM

1027.2—2016 中藥分子鑒定通則

第

2

部分：中藥提取物與中成藥中華人民共和國藥典（四部）3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1當(dāng)歸配方顆粒 Danggui

為傘形科植物當(dāng)歸

Angelica

sinensis

Diels

的干燥根經(jīng)炮制并按標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要質(zhì)量指標(biāo)加工制成的配方顆粒。4 儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合附錄

A

的要求。5 試劑試藥試劑試藥應(yīng)符合附錄

A

的要求。6 鑒別引物序列Danggui-224F：5'-

CTCGTGGAGCTGTACTGGTA

T/CACM

1027.201—2021Danggui-224R：5'-GGTAGTCCCGCCTGACCT

7 檢驗程序7.1 基本要求

提取和核酸擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行，進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即樣品制備區(qū)→核酸制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→檢測區(qū)。7.2 取樣送檢樣品總量應(yīng)不低于

g

3

等份，1/3

1/3

1/3留樣保存。收樣時應(yīng)檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標(biāo)簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。對商品包裝和送通則

進(jìn)行取樣。7.3 DNA

送檢樣品

提取步驟如下：a) 取樣品

1

g，粉碎成粉末；b) 取上述粉末

0.02

g，置

2

mL

離心管中，加入細(xì)胞核裂解液

30050

K

20RNA

酶

A

溶液

5

3

min，56℃下水浴

60

；c) 離心（12000

×g）

5

后，吸取上清液

250

至一新的

2

mL

離心管中，加入裂解緩沖液25012000

×g）5

mind) 往純化柱中加入洗脫液

12000

×g）1

min；e) 重復(fù)步驟

d）2

次；f) 棄去濾過液，再離心（12000

×g）2

，取出純化柱，室溫放置

2

min，晾干吸附材料中的剩余洗脫液；g) 將純化柱換入一個新的2

mL

100

μL，靜置3

min，離心（12000

×g）2

min，取濾過液的上清液，作為供試品溶液，可置-20

℃下保存?zhèn)溆?。除上述方法外，也可用等效?/p>

DNA。7.4 PCR

7.4.1 一般要求

PCR

聚合酶或

預(yù)混液的適用性。7.4.2 對照試驗送檢樣品應(yīng)平行檢測

2

7.3

DNA為

PCR

7.3

DNA，所獲的液體作為

擴(kuò)T/CACM

1027.201—2021增的陰性對照）和空白對照。7.4.3 PCR

反應(yīng)體系在

200μL

離心管中依次加入

2×

M5

SuperFast

PCR

Master

Mix

預(yù)混液

12.5μL、引物溶液（含正向和反向引物）各

（

ng50

ng）325

7.4.4 PCR

反應(yīng)參數(shù)將離心管置于

儀中，

反應(yīng)參數(shù)為：

5

次

(95

℃

30

s,

60

℃30

℃

30

s),

72

℃延伸

5

。

反應(yīng)結(jié)束后，取出

離心管，對反應(yīng)產(chǎn)物按

7.6

進(jìn)行檢測或置

4

℃下保存。7.5 限制性內(nèi)切酶酶切在

200μL

離心管中依次加入

反應(yīng)產(chǎn)物溶液

3μL，SmlI

限制性內(nèi)切酶

μL

儀，55

℃保溫

60

，取出離心，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測或置

4

℃下保存。7.6 擴(kuò)增/酶切產(chǎn)物檢測配制

2％瓊脂糖凝膠，膠中加入適量核酸染料

。取送檢樣品、陽性對照、陰性對照及空白對照的酶切反應(yīng)各

1

6

×上樣緩沖液各

5DL1000

2/1001“瓊脂糖凝膠電泳法（核酸檢測用）”試驗。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。8 結(jié)果判定在陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果符合規(guī)定的情況下，供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥

bp～200

bp

間有單一

9 結(jié)果報告9.1 一般要求檢測結(jié)果應(yīng)表示為陽性或陰性，陽性和陰性分別用“+”和“-”符號表示。9.2 檢測報告樣品經(jīng)檢測后，實驗室應(yīng)根據(jù)實驗的具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實驗記錄，出具檢測報告。檢測報告包含的基本內(nèi)容應(yīng)符合

T/CACM

1027.2—2016

10 質(zhì)量保證T/CACM

1027.201—2021兩份平行樣檢測結(jié)果應(yīng)一致。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性，另一份為陰性時，要重新測試。可以適當(dāng)增加核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中

DNA

模板量，使兩份試樣得到同樣的結(jié)果。平行樣本檢測結(jié)果不一致時應(yīng)檢測模板

的質(zhì)量，確保提取的

片段大于擴(kuò)增片段。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測，檢測結(jié)果不一致，可在測試報告中表述該實驗室樣品的測試結(jié)果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測低限。進(jìn)行

反應(yīng)前，應(yīng)確認(rèn)所使用的聚合酶符合本文件的要求。11 廢棄物處理檢測過程中的廢棄物處理應(yīng)符合

GB/T

27403

離心機(jī)最高重力離心力應(yīng)≥

12000

使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)或紫外透射儀等凝膠觀察設(shè)備

0.01

μL、10

μL、200

T/CACM

1027.201—2021附

錄 A（規(guī)范性）檢測用儀器設(shè)備和試劑試藥A.1 檢測用儀器設(shè)備檢測用儀器設(shè)備見表A.1。A.1

檢測用儀器設(shè)備A．2 試劑試藥除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含

DNA

和

DNase

的分析純或生化試劑；實驗用水符合

GB/T

的要求；所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、保存條件、失效日期和配制者姓名；PCR

試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染；材料及試劑的保存都應(yīng)有防污染措施。主要試劑與試藥包括：2×

M5

SuperFast

預(yù)混液、

提取試劑盒（可采用商品化

DNA

T/CACM

1027.201—2021

-20

述引物溶解至

10DL1000

分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液（DL1000

分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)凝膠電泳后應(yīng)出現(xiàn)

100

bp、200

bp、300

bp、

bp、

和

1000

電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、當(dāng)歸對照藥材粉末、20

mg/mL

蛋白酶

K

溶液、

mg/mL

核糖核酸酶

A（酶

A）溶液、SmlI

限制性內(nèi)切酶、10×限制性內(nèi)切酶緩沖液（應(yīng)根據(jù)不同限制性內(nèi)切酶選擇對應(yīng)的限

GelRed（10

mg/mL

或

10000×）、2％瓊脂糖凝膠。50×

電泳緩沖液配制方法：在

242

g

Tris，

g

乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O），加入

57.1

mL

的醋酸，充分混勻，加去離子水定容至

1

L，室溫保存，使用時用去離子水

50

倍稀釋?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。6×上樣緩沖液配制方法：在

80

mL

去離子水中溶解溴酚藍(lán)

0.25

g，二甲苯氰

FF

0.25

g，蔗糖40

g，加水定容至

mL，分裝?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。（2

1001

2.0（g

適量，加入電泳緩沖液

mL，加熱使溶脹完全，加人適量核酸染色劑，混勻，倒入插有鯊魚齒梳的模具中，待凝膠結(jié)成無氣泡的均勻薄層，即得。BA

T/CACM

1027.201—2021附

錄 B（資料性）當(dāng)歸配方顆粒

反應(yīng)體系的建立B.1 當(dāng)歸

PCR-RFLP

鑒別引物設(shè)計通過測序及從

數(shù)據(jù)庫查找正品當(dāng)歸及當(dāng)歸常見混偽品（獨(dú)活

Angelica

pubescens、白芷Angelica

dahurica、前胡

Peucedanum

praeruptorum、歐當(dāng)歸

Levisticum

officinale、及當(dāng)歸屬其他物種）

SNP

SmlI

識別位點（）上，當(dāng)歸可被酶切成短片段，當(dāng)歸混偽品不具有該識別序列，無法酶切，并設(shè)計相應(yīng)鑒別引物

Danggui-224F：5'-

-3'和

：-3',PCR

擴(kuò)增并使用

SmlI

內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后（即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶酶切長度多態(tài)性圖譜，PCR-RFLP

和

的短片段，當(dāng)歸混偽品無法擴(kuò)增不具有該識別序列，無法酶切，依然保留

224

bp

B.1

所示。T/CACM

1027.201—2021圖

B.1

當(dāng)歸特異性酶切鑒定引物設(shè)計B.2 聚合酶對

PCR

鑒別結(jié)果的影響選擇不同公司的

Taq

酶及其

Mix

進(jìn)行測試，包括

T5

Super

PCR

（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有M5

Taq

PCR

Master

MixMightyAmp

DNA

PolymeraseVer.2（Takara

u

Fly

SuperMix（全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測試。