不同來源甘薯與藜蘆配伍對大鼠cyp1a1、cyp3a4和cyp2e1酶活性的影響

不同來源甘薯與藜蘆配伍對大鼠cyp1a1、cyp3a4和cyp2e1酶活性的影響

細(xì)辛和甘蔗是中醫(yī)的18個對立藥物，屬于中藥的不良反應(yīng)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為以上兩種藥物不應(yīng)配合使用。目前對它們的研究僅局限在整體動物的毒性反應(yīng)或物質(zhì)基礎(chǔ)研究上,尚未見它們的體外代謝相互作用研究的報道。王艷麗等報道,兩者配伍后的毒性產(chǎn)生于細(xì)辛和藜蘆的共同作用,且藜蘆對配伍毒性的貢獻(xiàn)所占權(quán)重更大,但其對肝藥酶中三種重要亞酶CYP1A2、CYP3A4及CYP2E1的作用研究未見文獻(xiàn)報道。本研究將通過檢測藜蘆與三種不同來源細(xì)辛單獨(dú)使用及配伍用藥后實驗動物肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450酶系各主要成分含量的變化,研究配伍用藥后對這三種酶的作用及差異,進(jìn)一步探討三種細(xì)辛與藜蘆配伍相反作用的分子機(jī)制。1材料和機(jī)器1.1實驗動物及許可證清潔級SD大鼠80只,體質(zhì)量180~230g,雌雄各半,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(浙)2008-0036。1.2植物關(guān)于水的n.1.3.3細(xì)辛和藜蘆均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源研究所黃真教授鑒定為馬兜鈴科植物北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Shcmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、華細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.、漢城細(xì)辛AsarumsieboldiiMiq.var.seoulenseNakai和百合科植物藜蘆VeratrumnigrumL.;Folin酚試劑為北京惠澤奧公司產(chǎn)品;咖啡因,中國食品藥品檢定研究院,批號:100101-198403;氨苯砜、氯唑沙宗、氧化型輔酶Ⅱ二鈉(NADPNa2)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖均為美國Sigma公司產(chǎn)品;色譜純乙腈(美國Fisher公司);其他無機(jī)及有機(jī)試劑均為分析純。1.3速離子水浴Agilent-1100型高效液相色譜儀;低溫高速離心機(jī)(Biofuge28RS);-80℃低溫冰箱;JA5003型分析天平;SHZ-82型水浴恒溫振蕩器;島津UV-2200紫外分光光度計。2方法2.1微細(xì)水煎液的制備藜蘆水煎液的制備:藜蘆稱量質(zhì)量后加入10倍量水,浸泡90min后煎煮3次,每次1h,提取液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至含生藥量2g/mL;細(xì)辛水煎液制備方法及藥物濃度同上。細(xì)辛-藜蘆混合煎液按2010年版中國藥典一部附錄規(guī)定的臨床劑量比例4∶1稱量質(zhì)量混合,制備方法及藥物濃度同上,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2動物飼料給藥單次給藥取體質(zhì)量180~230g的SD大鼠80只,雌雄各半,置于室溫下飼養(yǎng),每天12h明暗交替,控制飲食,自由飲水。動物隨機(jī)分為8組,分別為空白對照組、藜蘆水煎液組、北細(xì)辛水煎液組、華細(xì)辛水煎液組、漢城細(xì)辛水煎液組、藜蘆與北細(xì)辛1∶4配伍水煎液組,藜蘆與華細(xì)辛1∶4配伍水煎液組,藜蘆與漢城細(xì)辛1∶4配伍水煎液組,每組10只,每天上午空腹灌胃中藥提取液1次,給藥前12h撤去動物飼料,其中配伍組給藥劑量含總生藥量0.25g/g,藜蘆單用組含生藥量0.05g/kg,細(xì)辛單用組含生藥量0.2g/kg,給藥時間為10d。空白對照組給予等體積生理鹽水。2.3組織勻漿、cacl2、k-l、8.3.3動物于末次給藥后禁食12h以上斷頭處死,開腹后迅速用注射器吸冰生理鹽水20~40mL經(jīng)肝門靜脈注射,以清除器官內(nèi)的殘留血液,直至肝臟呈土黃色,摘除肝臟并用濾紙吸干水分,剪碎肝組織并準(zhǔn)確稱取3.00g,加0.25mo1/L蔗糖溶液至15mL制成20%(m/V)的組織勻漿。勻漿液以15000×g離心15min沉淀未破碎的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、核及線粒體,所得上清部分即線粒體后上清液。小心倒出上清液,取12mL線粒體后上清液與1.2mL的88mmol/LCaCl2液混合,置冰浴中5min,輕輕攪拌數(shù)次,混合液在低溫高速離心機(jī)27000×g離心15min,棄上清液。所得微粒體用pH7.4的0.1mol/LTris液(含0.15mo1/LKCl)洗1次,以除去雜蛋白或過量的CaCl2,27000×g離心15min,棄上清液,于肝微粒體蛋白中按每1g肝組織加入1mL的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)懸浮,制成勻漿。以上操作均在低溫(≤4℃)下進(jìn)行。取部分稀釋并測定蛋白含量和酶活性水平,其余貯藏于-80℃冰箱中用于體外孵育實驗。2.4-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶系統(tǒng)的檢測用咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗這3種探針?biāo)幬镒鳛榇x底物,于反應(yīng)體系中加入摩爾濃度分別為40μmol/L的探針?biāo)幬?00μL,再向反應(yīng)體系中加入氧化型輔酶Ⅱ二鈉1.2mmol/L,6-磷酸葡萄糖12mmol/L,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6U,MgCl2溶液12mmol/L,酶(肝微粒體)1mg蛋白,以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)定容至2.0mL。37℃水浴中振蕩30min,立即放入冰浴終止反應(yīng)。再向反應(yīng)體系中加入1000μL氯仿,超聲振蕩2min,5000r/min離心5min,取有機(jī)相氯仿800μL,氮?dú)庀赂稍?加100μL流動相溶解,取20μL進(jìn)樣。流速為1.0mL/min,紫外檢測波長0~12min為265nm,12~25min為280nm。用咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗分別經(jīng)CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1代謝后的含量評價特異酶的活性。2.5高效液相色譜圖色譜條件:色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm,5.0μm)(大連依利特科學(xué)儀器有限公司),保護(hù)柱(4.6mm×10mm)(Waters),流動相為乙腈-水梯度洗脫(見表1),柱溫30℃,紫外檢測波長0~14min為265nm,14~40min為280nm。高效液相色譜圖見圖1。由該圖可見咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗3種探針?biāo)幬镏g分離良好,且未見干擾。2.6方法研究2.6.1探針?biāo)幬餀z測曲線于反應(yīng)體系加入各個濃度的咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗,其摩爾濃度分別為0.4、1.6、4、8、16、20、40μmol/L,加入100μL,再在反應(yīng)體系中加入氧化型輔酶Ⅱ二鈉1.2mmol/L,6-磷酸葡萄糖12mmol/L,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6U,MgCl2溶液12mmol/L,1mg空白對照組大鼠肝微粒體蛋白,以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)定容至2.0mL。振蕩混勻,再加入1000μL氯仿,超聲振蕩2min,5000r/min離心5min,取有機(jī)相氯仿800μL,氮?dú)庀赂稍?加100μL流動相溶解,取20μL進(jìn)樣。以探針?biāo)幬锏姆迕娣e為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗在0.4~40μmol/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3個探針?biāo)幬锏臉?biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)指標(biāo)見表2。2.6.2投料比和加樣回樣按“2.6.1”項中所述方法,于空白對照組大鼠肝微粒體蛋白中加入3個濃度的咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗,3種探針?biāo)幬锏哪枬舛确謩e為1.6、8、40μmol/L,進(jìn)行高、中、低3個濃度的日間日內(nèi)誤差實驗。統(tǒng)一處理樣品,分為3d進(jìn)樣,每天進(jìn)樣5個,同一天內(nèi)所進(jìn)樣品做比較為日內(nèi)誤差,3天間樣品做比較為日間誤差。測得咖啡因日間及日內(nèi)RSD在0.15%~1.63%,氨苯砜日間及日內(nèi)RSD在0.054%~1.68%,氯唑沙宗日間及日內(nèi)RSD在0.046%~2.24%。2.6.3色譜條件測定精密吸取濃度為40μmol/L的咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗對照品溶液20μL,分別于0、2、4、8、12、18、24h,按上述色譜條件測定,藥物咖啡因的平均峰面積為416.7429,RSD為1.3362%;氨苯砜的平均峰面積為630.5143,RSD為0.1463%;氯唑沙宗的平均峰面積為249.8143,RSD為0.1657%。結(jié)果表明藥物咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.6.4探針?biāo)幬锘厥章蕼y定按“2.6.1”項中所述方法,精密加入3個濃度的咖啡因、氨苯砜和氯唑沙宗,3種探針?biāo)幬锏哪枬舛确謩e為1.6、8、40μmol/L,依法進(jìn)行測定并計算標(biāo)準(zhǔn)品探針?biāo)幬锔摺⒅?、?個濃度的絕對回收率。測得咖啡因加樣回收率在95.56%~99.63%,氨苯砜加樣回收率在98.22%~100.05%,氯唑沙宗加樣回收率在99.24%~100.17%。2.7統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)以±s表示,以SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)差異分析采用單因素方差分析方法,以P<0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。3同工酶的表達(dá)按“2.4”項下方法,用HPLC對Cocktail探針?biāo)幬锏拇x率進(jìn)行檢測,藜蘆與三種細(xì)辛單獨(dú)使用及配伍用藥對大鼠肝細(xì)胞色素P450重要同工酶活性的影響結(jié)果見表3。與空白對照組比較,單藥組中藜蘆可顯著抑制CYP1A2、CYP3A4及CYP2E1(P<0.001),北細(xì)辛對CYP2E1有顯著抑制作用(P<0.001),北細(xì)辛與藜蘆配伍對CYP1A2、CYP3A4及CYP2E1均有顯著抑制作用(P<0.001);而華細(xì)辛對CYP3A4和CYP2E1有顯著抑制作用(P<0.01),華細(xì)辛與藜蘆配伍可誘導(dǎo)CYP1A2(P<0.05)、抑制CYP3A4和CYP2E1(P<0.01);漢城細(xì)辛可抑制CYP3A4(P<0.05)和CYP2E1(P<0.01),漢城細(xì)辛與藜蘆配伍可誘導(dǎo)CYP1A2(P<0.05)、抑制CYP3A4和CYP2E1(P<0.01)。另外,配伍后各組對同工酶的抑制作用或誘導(dǎo)作用較配伍前均有顯著增強(qiáng)的趨勢。藜蘆與不同細(xì)辛配伍后對肝細(xì)胞色素P450亞酶的含量影響是有差異的,出現(xiàn)該結(jié)果可能與不同細(xì)辛中化學(xué)成分的組成或含量不一致有關(guān)。4同工酶的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制Cocktail探針?biāo)幬锓ㄊ且淮谓o予兩種或多種的探針?biāo)幬锏姆椒?。目前Cocktail探針?biāo)幬锓ǖ膽?yīng)用廣泛,可用于體內(nèi)外測定細(xì)胞色素P450酶的活性。對體內(nèi)藥物代謝酶活性的定量測定具有重要的應(yīng)用價值:可用于研究代謝酶活性與疾病之間的關(guān)系,研究藥物間的相互作用,同時也可以應(yīng)用在遺傳變異性的研究中。本實驗采用Cocktail探針法來研究藜蘆與三種不同來源細(xì)辛單獨(dú)及配伍用藥前后對CYP450重要同工酶活性的影響。結(jié)果顯示:Cocktail探針?biāo)幬锇Х纫?、氨苯砜、氯唑沙?同時經(jīng)大鼠肝微粒體酶體外代謝后,沒有發(fā)生藥物間的相互作用,因此Cocktail探針?biāo)幬锿瑫r給予來檢測多個代謝酶水平的方法是可行的。CYP450超基因大家族由多種同工酶組成,其中本實驗中研究的CYP1A2、CYP3A4及CYP2E1與藥物代謝密切相關(guān)。CYP1A2在肝組織中有特異性表達(dá),約占P450總量的13%。在外源性物質(zhì)包括一些藥物的代謝中起重要作用,也包括許多前致癌物,而咖啡因是研究CYP1A2的經(jīng)典探針?biāo)幬铩YP3A4是公認(rèn)肝臟中含量最豐富的CYP酶,約占肝臟CYP總量的50%。該酶在多種外源性物質(zhì)如污染物、前致癌物和藥物的代謝中起到至關(guān)重要的作用,是最重要的P450酶。而氨苯砜可作為CYP3A4理想的探針?biāo)幬铩YP2E1的含量很豐富,約占成人肝臟P450總量的7%。它主要參與許多毒性小分子和很少量藥物的轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在已經(jīng)明確的是環(huán)境因素可能引起許多疾病甚至是癌癥的發(fā)生,而CYP2E1則可能與之有關(guān)。氯唑沙宗是CYP2E1的經(jīng)典探針?biāo)幬?且可能是目前唯一的探針?biāo)幬?。單味中藥或中藥?fù)方應(yīng)用可通過對CYP酶系相應(yīng)亞家族選擇性地誘導(dǎo)和抑制,從而改變單純使用某種中藥的療效和毒性反應(yīng)。中藥對CYP產(chǎn)生的廣泛影響不僅可推測中藥的某些臨床療效和部分作用機(jī)制,而且可指導(dǎo)臨床合理準(zhǔn)確用藥,從而避免藥物相互作用的發(fā)生。因此,在臨床上應(yīng)對中草藥可能引起的藥物相互作用給予足夠的重視。研究結(jié)果顯示,大鼠連續(xù)給藥誘導(dǎo)10d后,三種細(xì)辛與藜蘆配伍組與藥物單用組比較,配伍組的P450同工酶含量均明顯受抑制或誘導(dǎo),且受影響的程度較單藥應(yīng)用有顯著性變化。推測其配伍后可能通