奶牛血清中no含量和一氧化氮合酶活性的測(cè)定

奶牛血清中no含量和一氧化氮合酶活性的測(cè)定

近年來，我國(guó)奶牛酮病的發(fā)病率顯著增加，尤其是隱酮病，降低了牛奶產(chǎn)量，影響了奶牛業(yè)的發(fā)展。奶牛酮病在世界各國(guó)都有發(fā)生，特別是在規(guī)模化奶牛場(chǎng)已成為危害奶牛業(yè)的主要疾病之一。奶牛酮病是高產(chǎn)奶牛產(chǎn)犢后6周內(nèi)最常發(fā)生的一種以碳水化合物和揮發(fā)性脂酸代謝紊亂為基礎(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)代謝病。臨床表現(xiàn)為頑固性消化紊亂，呼出氣有酮味，產(chǎn)奶量下降，機(jī)體脫水和一定的神經(jīng)癥狀。臨床特征為酮血、酮尿、酮乳、低血糖、血漿游離脂肪酸濃度升高和肝糖元含量降低。為了進(jìn)一步研究奶牛酮病的發(fā)生機(jī)理，我們首次對(duì)奶牛酮病血清中NO含量及NOS活性進(jìn)行了測(cè)定。旨在深入揭示酮病的發(fā)生機(jī)理，為臨床防治該病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黑龍江某牛場(chǎng)泌乳量在6.5×103kg以上的3～6胎荷斯坦奶牛。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備7230分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋渦混勻器（上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠）。1.3合酶含量測(cè)定試驗(yàn)一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）測(cè)定試劑盒，南京建成生物研究所。亞硝基鐵氰化鈉，無水碳酸鈉，硫酸銨（分析純），天津市化學(xué)試劑一廠。2實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酮粉法和改良式水楊醛比色法對(duì)黑龍江某農(nóng)場(chǎng)的荷斯坦奶牛進(jìn)行酮病抽樣檢測(cè)。分為兩組，每組10頭，分別為對(duì)照組和陽性組。2.2血清中一氧化氮含量的測(cè)定血清中一氧化氮（NO）含量的測(cè)定采用硝酸還原酶法。2.3血清中一氧化氮酶nos活性的測(cè)定血清中一氧化氮合酶（NOS）活性的測(cè)定采用硝酸還原酶法。2.4處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理采用SAS軟件處理。3結(jié)果3.1酮病陽性牛的診斷結(jié)果3.1.1乳中酮含量的測(cè)定酮體的含量與實(shí)驗(yàn)色澤反應(yīng)的快慢，深淺成正比，陰性反應(yīng)成土褐色，陽性結(jié)果以“+”表示，并代表乳中酮體的大約含量。陽性牛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示有紫色跡象，并逐漸加深，于30秒達(dá)頂點(diǎn)者為（++++），表示乳中約含酮體4.0mmol/L以上（見圖1）。3.1.2楊樹業(yè)比色法的診斷結(jié)果在酮粉法診斷結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用改良式水楊醛比色法測(cè)定血清酮體的含量（結(jié)果見表1），根據(jù)上述兩種方法選擇實(shí)驗(yàn)陽性牛。3.2no含量和nos活性的測(cè)定血清中NO含量及NOS活性測(cè)定結(jié)果見表2。4nos及l(fā)-arg的生成機(jī)制酮病的發(fā)生機(jī)理很復(fù)雜，但普遍接受的是糖缺乏理論。機(jī)體低血糖是產(chǎn)生酮病的關(guān)鍵。由于各種原因所致碳水化合物供應(yīng)不足及高泌乳消耗大量的糖，導(dǎo)致機(jī)體低血糖及能量負(fù)平衡。為此，動(dòng)用體脂肪和體蛋白補(bǔ)充能量的不足。但是，脂肪和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的游離脂肪酸和生酮氨基酸，經(jīng)肝臟的β-氧化為乙酰CoA，乙酰CoA可與草酰乙酸縮合成檸檬酸經(jīng)三羧酸循環(huán)氧化供能。如果生成草酰乙酸的先質(zhì)丙酸的碳水化合物不足，使得大量乙酰CoA不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致酮體蓄積，進(jìn)而引起一系列的代謝與機(jī)能紊亂。NO是一種難溶于水的氣體，因?yàn)樗姆肿咏Y(jié)構(gòu)中具有不配對(duì)電子，所以它也是一種自由基。NO在免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌的過程中起作用，它能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，參與炎癥與組織損傷，在呼吸、消化、循環(huán)、免疫等全身多系統(tǒng)的生理、病理及有關(guān)臨床疾病中起著重要作用。NO是由NOS催化L-精氨酸（L-Arg）而生成的，而NO體內(nèi)的合成，主要是取決于血漿與胞漿內(nèi)其前體L-Arg的含量、細(xì)胞膜對(duì)L-Arg的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和NOS的活性。NOS存在于體內(nèi)許多臟器細(xì)胞，至少有兩種異構(gòu)體，其中iNOS為誘導(dǎo)型NOS，主要存在于巨噬細(xì)胞中，不依賴鈣；cNOS為結(jié)構(gòu)型NOS，主要存在于細(xì)胞內(nèi)，需鈣離子或鈣調(diào)蛋白和NADPH的參與。由于酮體主要成分是酸性物質(zhì)，其大量積存的結(jié)果常導(dǎo)致動(dòng)物酸堿平衡失調(diào)，引起酸中毒，因此機(jī)體內(nèi)易發(fā)生缺氧。而L-Arg主要來源于細(xì)胞外組織間液，經(jīng)細(xì)胞膜上蛋白氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（CAT-1,CAT-2）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但是缺氧時(shí)肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，NOS蛋白生成減少。慢性低氧可導(dǎo)致L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，所以會(huì)影響NO的生成。另外，NOS的活性在酸性條件下活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致NO的合