藥用植物鞣質(zhì)的多元酚類化合物

藥用植物鞣質(zhì)的多元酚類化合物

這種結(jié)構(gòu)通常存在于植物體內(nèi)，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多樣性苯酚類化合物。鞣質(zhì)能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶于水的沉淀,故可用來鞣皮,即與動物皮革中的蛋白質(zhì)相結(jié)合,使皮革成為致密、柔韌、難于透水且不易腐敗的革,因此稱為鞣質(zhì)。鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)類型可分為三大類:水解鞣質(zhì)、縮合鞣質(zhì)以及縮合鞣質(zhì)與水解鞣質(zhì)中的葡萄糖以碳鍵連接而成的復(fù)合鞣質(zhì)。鞣質(zhì)的多元酚類結(jié)構(gòu)賦予它一系列獨特的化學(xué)性質(zhì),具有很強(qiáng)的生物和藥理活性。鞣質(zhì)與蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的結(jié)合能力,與生物堿、酶、金屬離子等反應(yīng)活潑,此外還有較強(qiáng)的表面活性,并對人體一些傷病有直接的生物療效。因此,其在醫(yī)藥、食品、化妝品、制革、冶金、印染、選礦等工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用。隨著鞣質(zhì)研究的不斷深入,對鞣質(zhì)的定性定量分析提出了更高的要求,作者從鞣質(zhì)的提取、分離、鑒定和含量測定方法等幾個方面進(jìn)行綜述。鑒于鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征,本文著重對鞣質(zhì)的通用分離和分析方法進(jìn)行了歸納。1機(jī)溶劑提取法鞣質(zhì)的提取方法多種多樣。經(jīng)典的提取方法有溫水浸提法、有機(jī)溶劑提取法。新型的提取方法有超聲波法、微波法、超臨界流體萃取、膜技術(shù)、半仿生、高壓水提法等,將現(xiàn)代與傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合,提取效率和純度大大提高,為鞣質(zhì)提供了廣闊的應(yīng)用前景。2鉻分離目前已報道的鞣質(zhì)分離方法有分級沉淀法、活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、膜分離法、離子交換法等。2.1沉淀來分離制度分級沉淀是根據(jù)鞣質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離。用不同濃度的有機(jī)溶劑,如甲醇、乙醇、丙酮等分級沉淀來分離鞣質(zhì)。一般采用乙醇作為溶劑。鄭玲玲采用明膠沉淀總鞣質(zhì),丙酮溶液使沉淀物溶解釋放鞣質(zhì),初步分離老鸛草提取液,優(yōu)化工藝參數(shù)為:4%明膠溶液(10∶1)沉淀,50%丙酮溶解。有機(jī)溶劑分級沉淀法對設(shè)備要求不高,成本低,但易引入有害物質(zhì),安全性受到質(zhì)疑。2.2活性炭雜質(zhì)活性炭是一種多孔性的含炭物質(zhì),它具有高度發(fā)達(dá)的孔隙構(gòu)造,活性炭的多孔結(jié)構(gòu)為其提供了大量的表面積,能與流體(雜質(zhì))充分接觸,從而賦予活性炭所特有的吸附性能,使其非常容易達(dá)到吸附除掉雜質(zhì)的目的。汪詠梅等利用活性炭除去單寧酸中色素、樹膠等雜質(zhì),可使單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高1%左右,顏色和透射率則有明顯改善,有助于產(chǎn)品總體質(zhì)量的提高。2.3極性樹脂固載大孔樹脂吸附法主要優(yōu)勢是針對不同的原材料可以選用不同性質(zhì)的樹脂,達(dá)到優(yōu)化分離的目的。一般非極性物質(zhì)在極性介質(zhì)(水)中易被非極性樹脂吸附,極性物質(zhì)在非極性介質(zhì)中易被極性樹脂吸附,帶強(qiáng)極性基團(tuán)的吸附劑在非極性溶劑里能很好地吸附極性化合物。聚苯乙烯樹脂一般適用于非極性和弱極性物質(zhì)的化合物,如皂苷類和黃酮類。聚丙烯酸類樹脂一般帶有酯基或酰氨基,對中極性和極性化合物如黃酮醇和酚類的吸附較好。李慶等用D141大孔吸附樹脂對藏邊大黃鞣質(zhì)進(jìn)行分離純化,D141大孔樹脂的靜態(tài)吸附鞣質(zhì)量為27.5mg/g。大孔樹脂具有吸附選擇性好、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、易于構(gòu)成閉路循環(huán)和節(jié)省費用等優(yōu)點,可廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的分離純化。2.4分離、提純法膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為分離介質(zhì),當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推力(如壓力差、濃度差和電位差)時,原料側(cè)組分依據(jù)分子大小選擇性地透過膜,以達(dá)到分離、提純的目的。該方法具有高效、過程基本無相變、可在常溫下運作及工藝簡單、操作方便、投資省等優(yōu)點,已成為一項新興的用于澄清、分離和濃縮等方面的綠色節(jié)能技術(shù)。杜運平等采用膜分離技術(shù)優(yōu)選純化板栗苞單寧的工藝條件,研究結(jié)果表明,在最佳工藝條件下,其截留液單寧含量可達(dá)64%左右,濁度在0.8比濁度濁度單位(NTU)以下。該方法具有操作簡單、高效節(jié)能、綠色環(huán)保等優(yōu)點,為進(jìn)一步開發(fā)單寧生產(chǎn)工藝提供了技術(shù)參考。2.5離子交換色譜離子交換技術(shù)是根據(jù)某些溶質(zhì)能解離為陽離子或陰離子的特性,利用離子交換劑與不同離子結(jié)合力強(qiáng)弱的差異,將溶質(zhì)暫時交換到離子交換劑上,然后用適合的洗脫劑將溶質(zhì)離子洗脫下來,使溶質(zhì)從原溶液中分離、濃縮或提純的操作技術(shù)。章紹兵等為獲得高純度的肽組分,依次采用離子交換色譜和凝膠過濾純化水酶法提取工藝獲得菜籽粗肽。經(jīng)離子交換色譜純化后,糖和單寧含量顯著降低。2.6凝膠的過濾處理凝膠柱色譜是以多孔性凝膠填料為固定相,按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。用于鞣質(zhì)分離的凝膠中,最常用的是SephadexLH-20,主要針對不同聚合度鞣質(zhì)的分離,分離時受每一鞣質(zhì)吸附力的影響而不受凝膠過濾的影響。原花青素可以使用SephadexLH-20柱色譜進(jìn)行分離,首先用乙醇洗脫非鞣質(zhì)類成分,然后用丙酮-水或乙醇-水洗脫原花青素。2.7高速回流色譜法hsc近年來,在多酚類化合物的分離方面,液滴逆流色譜法(DCCC)被作為替代液相色譜技術(shù)的一種方法。優(yōu)點是操作條件溫和,高載樣量,強(qiáng)分離能力,不需要固體支持劑,避免因各物質(zhì)的吸附而造成鞣質(zhì)的損失。高速逆流色譜法(HSCCC)是在DCCC基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,彌補了DCCC展開時間長的缺點。Degenhardt等采用HSCCC分離花青素,溶劑系統(tǒng)為叔丁基甲基醚/正丁醇/乙腈/水(2∶2∶1∶5),采用三氟乙酸酸化。2.8正相hplc分離高效液相色譜(HPLC)技術(shù)已經(jīng)廣泛用于分離多酚類化合物。正相HPLC能夠依據(jù)原花青素的聚合度進(jìn)行分離,一直到十聚體。反相HPLC可以分離黃烷-3-醇單體和低聚體,尤其是二聚體和三聚體,但并不按照聚合度大小順序洗脫。3抗鉻測定方法3.1兒茶素類縮合鞣質(zhì)鞣質(zhì)一般可用三氯化鐵反應(yīng)、溴水反應(yīng)、乙酸鉛反應(yīng)、香草醛-濃硫酸反應(yīng)、二甲氨基苯甲醛反應(yīng)、甲醛濃鹽酸-硫酸鐵銨等反應(yīng)鑒別。如果三氯化鐵反應(yīng)無色,提示無鞣質(zhì)或有單取代酚羥基的縮合鞣質(zhì);三氯化鐵反應(yīng)顯藍(lán)色,一般為具鄰三酚羥基化合物,可分為水解鞣質(zhì)和沒食子兒茶酸縮合鞣質(zhì);三氯化鐵反應(yīng)顯深綠色,一般具鄰二酚羥基化合物,可分為鄰二酚羥基的黃酮和兒茶素類縮合鞣質(zhì)。如果溴水反應(yīng)有黃或橙紅色沉淀為縮合鞣質(zhì)。如果乙酸鉛反應(yīng)有沉淀且沉淀溶于乙酸的為縮合鞣質(zhì)。如果香草醛濃硫酸反應(yīng)與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)呈紅色,說明存在兒茶素類縮合鞣質(zhì)。如果甲醛濃鹽酸-硫酸鐵銨反應(yīng)有櫻紅色沉淀,說明存在縮合鞣質(zhì)。3.2食子酸重現(xiàn)性和pc法分離進(jìn)一步的分析一般用薄層色譜(TLC)法、紙色譜(PC)法等。TLC法應(yīng)用較多,檢測鞣質(zhì)的分解產(chǎn)物沒食子酸的重現(xiàn)性好,靈敏度高,斑點集中較清晰。PC法分離效果差,斑點重疊不集中,拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。也可用HPLC法區(qū)分各種鞣質(zhì)類型,HPLC可識別植物提取物中的鞣質(zhì)是普通鞣質(zhì)還是咖啡酰鞣質(zhì)、類黃酮鞣質(zhì)或其他物質(zhì),需用的樣品量和紫外法差不多,在研究植物中鞣質(zhì)和與其有關(guān)的多酚化合物分布情況方面特別有效。3.3cd譜分析法近年來,各種光譜技術(shù)在鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定得到了廣泛的應(yīng)用,如X衍射、圓二色譜(CD)、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、磁共振氫譜(1HNMR)、磁共振碳譜(13CNMR)以及液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用等。應(yīng)用CD譜可以確定鞣質(zhì)中六羥基聯(lián)苯基(HHDP)、去氫六羥基聯(lián)苯基(DHHDP)的絕對構(gòu)型;應(yīng)用1HNMR并結(jié)合化學(xué)降解產(chǎn)物的比旋度可分析得到整個分子的絕對構(gòu)型;應(yīng)用13CNMR可以確定整個分子的碳骨架,和各個官能團(tuán)之間的結(jié)合位置。這些光譜技術(shù)和色譜分離方法結(jié)合在一起,已經(jīng)闡明了數(shù)百種新鞣質(zhì)化合物的結(jié)構(gòu)。隨著更先進(jìn)的色譜、光譜技術(shù)和新的檢測手段的出現(xiàn),相對分子質(zhì)量在500~3000的鞣質(zhì)類化合物的結(jié)構(gòu)測定將不會成為困擾人們的問題,只要分離出鞣質(zhì)單體,就能鑒定出它的結(jié)構(gòu)。Fernandes等采用液相色譜串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜(HPLC-DAD/ESI-MS)鑒定了33個多酚類化合物的結(jié)構(gòu)。4高效定量測定法鞣質(zhì)的經(jīng)典含量測定方法有很多種,重量法、容量法、比色法和分光光度法等,這些方法至今仍被大量用于鞣質(zhì)的含量測定,它們的特點是簡單,容易操作,不需要貴重的儀器。其中,最常用的經(jīng)典定量方法有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡(luò)合滴定法、比色法和分光光度法。近年在鞣質(zhì)含量測定方面也出現(xiàn)了一些新的方法,包括HPLC法、原子吸收分光光度法、薄層掃描法、熱透鏡光譜法、高靈敏示波電位動力學(xué)分析法、電化學(xué)傳感器法等。它們具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度和不易受干擾的共同特點,目前已成為鞣質(zhì)分析研究的主要手段。4.1皮粉法和皮粉法測定血藥中鞣質(zhì)含量的比較皮粉法是國際公認(rèn)的鞣質(zhì)含量測定方法。皮粉中的主要成分是蛋白質(zhì),鞣質(zhì)可通過分子中的酚羥基與蛋白質(zhì)中的酰胺基形成氫鍵而結(jié)合,形成不溶于水的沉淀,因此可通過重量分析測定鞣質(zhì)含量。皮粉法適用的范圍非常廣,缺點是耗用樣品多,測定時間長,而且沒有選擇性,其測定結(jié)果往往偏高,故一般只適用于測定鞣質(zhì)含量高的生藥,樣品較少或含量低的則不適于采用該法測定。李嬈嬈等采用磷鉬鎢酸-干酪素比色法和皮粉法分別測定槐花、炒槐花和槐花炭中鞣質(zhì)含量,采用SPSS軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果兩種方法所測得的槐花3種飲片中鞣質(zhì)含量無顯著性差異。4.2表現(xiàn)為生理活性的鞣質(zhì)和無生理活性的鞣質(zhì)干酪素法的特點在于干酪素能選擇性地結(jié)合有生理活性的鞣質(zhì),因此測出的是有生理活性的鞣質(zhì),而無生理活性的鞣質(zhì)如鞣酐則不被測定,選擇性比皮粉法要高,一般適于測定鞣質(zhì)含量較低的物質(zhì)。李志猛等采用干酪素法快速、準(zhǔn)確測定了8個不同產(chǎn)地金櫻子中鞣質(zhì)的含量,以產(chǎn)地為西安的鞣質(zhì)含量最高(3.96%)。4.3樣品中0.2%高錳酸鉀法利用鞣質(zhì)有較多酚羥基易被氧化的性質(zhì),用高錳酸鉀溶液滴定樣品液中鞣質(zhì)。高錳酸鉀法同皮粉法一樣選擇性較小,易受樣品中還原性物質(zhì)干擾,誤差較大,最大的優(yōu)點是操作簡單。4.4ph值對螯合物沉淀的影響鞣質(zhì)分子內(nèi)的多個鄰位酚羥基可作為多基配體與一個中心離子,如銅、錫、鉍、鋅、汞和鐵等絡(luò)合,形成環(huán)狀的螯合物,在不同的pH值下發(fā)生沉淀。絡(luò)合滴定法就是利用鞣質(zhì)這一性質(zhì),通過用EDTA返滴定過量金屬離子來確定鞣質(zhì)的含量。江凱等通過正交實驗法優(yōu)化了五倍子單寧的超聲波提取條件,采用EDTA絡(luò)合滴定法測定單寧含量。4.5比色計測定吸光度比色法利用某些試劑與鞣質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng),用比色計測定吸光度以確定鞣質(zhì)含量。常用的試劑有香草醛(vanillin)、普魯士藍(lán)和Folin-Ciocalteu試劑等。4.5.1鞣質(zhì)含量的確定香草醛法是利用香草醛與縮合鞣質(zhì)反應(yīng)生成有顏色的復(fù)合物,用比色計測定吸光度以確定鞣質(zhì)含量。影響因素有溶劑的種類、酸的性質(zhì)和濃度、反應(yīng)時間、溫度、香草醛的濃度和參考標(biāo)準(zhǔn)的類型。Chavan等使用含4%HCl(V/V)的0.5%香草醛甲醇溶液測定了野豌豆、青豌豆和草豌豆提取物中縮合鞣質(zhì)的含量。4.5.2試劑的添加順序普魯士藍(lán)法是測定總酚含量比較流行的一種方法,簡單、快速,非酚類物質(zhì)影響較小。缺點是短暫的潛伏期后才能生成沉淀,隨著時間的延長色度加深,溫度和pH值也影響色度,試劑的添加順序也會影響普魯士藍(lán)的形成。顯色原理為:多酚+2Fe(CN)3?663-(鐵氰離子)?→→被氧化的多酚+2Fe(CN)4?664-(鐵氰離子)3Fe(CN)4?664-(鐵氰離子)+4Fe3+?→Fe4[Fe(CN)6]3+4Fe3+→Fe4[Fe(CΝ)6]3(普魯士藍(lán))4.5.3酚羥基定量氧化法Folin-Ciocalteu試劑含有磷鉬酸,它使酚酸分子中酚羥基定量氧化,本身被還原生成磷鉬藍(lán)而顯色。Vallverdú-Queralt等采用Folin-Ciocalteu法測定了西紅柿產(chǎn)品中總酚的含量。4.6%鹽酸-丁醇、甲胺基-重鉻酸鉀試劑和偏釩酸銨試劑分光光度法是利用鞣質(zhì)與某些試劑反應(yīng)生成有色化合物,通過測定吸光度確定樣品中的鞣質(zhì)含量。該方法在目前的應(yīng)用最為廣泛。常用的顯色劑有氯化鐵、氯化鐵-1,10-二氮雜菲、Folin-Ciocalteu試劑、5%鹽酸-丁醇、甲胺基粉-重鉻酸鉀溶液、FolinDAB8試劑、Folin-Denis試劑和偏釩酸銨等。該法已被用于檢測果汁、果渣、啤酒、茶葉、高粱、制革污水和中藥如五倍子中鞣質(zhì)含量的檢測。王添敏等采用分光光度法于760nm處分別測定胡桃楸的根、莖枝、葉和果皮中總鞣質(zhì)的含量,結(jié)果胡桃楸不同藥用部位中鞣質(zhì)含量明顯不同,總鞣質(zhì)含量的順序為葉>根>莖枝>果皮。Baloyi等以5%鹽酸-丁醇試劑為顯色劑測定津巴布韋種植的豇豆、銀葉營多藤和兩種柱花草中縮合鞣質(zhì)的含量。李茂等以Folin-Denis試劑為顯色劑,采用分光光度法于756nm處分別測定15種熱帶喬灌木單寧含量。4.7實生樹測定養(yǎng)成工藝HPLC在鞣質(zhì)分析中的應(yīng)用,為鞣質(zhì)定量分析提供了新的途徑,已成為鞣質(zhì)含量測定非常有效和準(zhǔn)確的方法。Haase等采用HPLC法測定樹葉中縮合鞣質(zhì)的含量。Pfundstein等采用高效液相色譜法測定埃及藥用植物果實中多酚化合物的含量。4.8離子間接測定鞣質(zhì)含量的方法原子吸收分光光度法是利用鞣質(zhì)與金屬離子發(fā)生沉淀反應(yīng)后,通過測定過量金屬離子間接測定鞣質(zhì)含量的一種方法,沉淀劑一般為銅離子的乙酸銨溶液。該方法簡單快速,不受顏色及共存物質(zhì)的干擾。Yebra等采用原子吸收分光光度法測定了白酒和茶葉中鞣質(zhì)含量,并結(jié)合流動注射分析技術(shù)用于工業(yè)上的實時質(zhì)量監(jiān)測。4.9檢測限的提高Calderaforteza等報道了用熱透鏡光譜法測定白葡萄酒中鞣質(zhì)的含量,其檢測限達(dá)到了5ng/ml,與分光光度法約為100ng/ml的檢測限相比,有了飛速的提高,為樣品中痕量鞣質(zhì)的含量測定開辟了新的途徑。4.10藥品質(zhì)量檢驗薄層掃描法是指用一定波長的光照射在薄層板上,對TLC中有紫外或可見吸收的斑點進(jìn)行掃描,將掃描的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢驗方法。該方法測定鞣質(zhì)含量簡單、快速、穩(wěn)定,具有樣品處理簡單、不需任何顯色劑的特點,大大增強(qiáng)了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.11多酚化合物的測定Freire等以電化學(xué)傳感器作為檢測器,測定了環(huán)境基質(zhì)中多酚化合物的含量。該檢測器對酚類和氯酚非常敏感,對微量酚類化合物具有非常高的選擇性。4.12原反應(yīng)與圖示波電位法的結(jié)合高靈敏示波電位動力學(xué)分析法是利用KBrO3和KBr的氧化還原反應(yīng)與單寧的溴化反應(yīng)之間的差異,將動力學(xué)分析法和示波電位法結(jié)合起來,能夠測定μg/L級的單寧,而且直觀靈敏,測定范圍寬,不受顏色及沉淀的影響。適于飲料及生物樣品中痕量鞣質(zhì)的測定。4.13低聚原花青素和其他酚類的含量Furuuchi等采用H