生物化學課件（生物技術類）之第36章RNA合成

36.1基因轉錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶36.2RNA合成涉及三個過程：起始，延伸和終止36.3一些抗生素是RNA合成的抑制劑。36.4初始RNA轉錄物都需經轉錄后加工36.5核酶是個位置特異的核酸內切酶36.6基因轉錄調控－操縱子模型第36章、RNA合成36.1基因轉錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶第36章、1RNA合成示意圖模板鏈解旋重新纏繞轉錄方向編碼鏈轉錄泡RNA聚合酶活性部位DNARNA合成示意圖模板鏈解旋重新纏繞轉錄方向編236.1基因轉錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶是由5個蛋白亞基組成的，分別被命名為

，

ˊ，

（2個），和

亞基。其中

亞基是催化亞基，核心酶的分子量大約是350000。大腸桿菌RNA聚合酶全酶還含有第六個亞基，稱之

亞基（分子量為70000），與核心的RNA聚合酶瞬時結合，其功能是識別模板上的啟動子，使RNA聚合酶與啟動子結合。一旦延伸開始

亞基就脫離聚合酶。36.1基因轉錄需要DNA依賴性的RNA聚合酶3真核生物存在著三種不同的RNA聚合酶：RNA聚合酶I（RNApolI）、RNA聚合酶II（RNApolII）和RNA聚合酶III（RNApolIII）。每一種聚合酶都含有很多亞基，它們承擔的任務各不相同。真核生物存在著三種不同的RNA聚合酶：RN436.2RNA合成包括三個階段：起始、延伸和終止起始延伸終止36.2RNA合成包括三個階段：起始、延伸和終止起始延伸終5

當E.coliRNA聚合酶結合到模板上的啟動子后，就開始了RNA的合成。細菌啟動子要行使其功能需要兩個高度保守DNA序列，一個序列區(qū)是處于開始轉錄的第一個核苷酸的5ˊ端之前（習慣稱之上游）的－35區(qū)，（上游核苷酸編號為“－”），提供RNA聚合酶識別信號。另一個保守區(qū)稱為－10區(qū)，即轉錄起始點上游的10個核苷酸，提供DNA雙鏈解旋信號。RNA聚合酶首先沿著DNA滑動直至遇到－35區(qū)，形成一個起始的蛋白-DNA復合體（包括

亞基），稱為封閉性復合體。這個復合體向3ˊ方向移動到－10區(qū)，啟動DNA雙鏈解旋，將模板上的轉錄起始點暴露出來，此時RNA聚合酶和DNA形成的復合體稱為開放性復合體，它構成了活性的轉錄單元。－10區(qū)是個富含A-T的區(qū)，由于A-T堿基對之間的氫鍵弱，所以容易使螺旋解旋。（a）轉錄在啟動子調控下起始當E.coliRNA聚合酶結合到模板上的啟動6來自噬菌體和細菌的10個基因的啟動子序列來自噬菌體和細菌的10個基因的啟動子序列，這些啟動子都可被RNA聚合酶中的

70亞基（E.coli中最常見的一種

亞基）識別。298個大腸桿菌啟動子共有序列來自噬菌體和細菌的10個基因的啟動子序列來自噬菌體和細菌的17（b）鏈延伸是一個核苷?；D移反應

RNA聚合酶催化鏈沿著5ˊ至3ˊ方向延伸。鏈延伸所需的下一個核苷三磷酸經聚合酶驗證與模板上相應的未配對的核苷酸正確地形成氫鍵，然后RNA聚合酶催化延伸著的RNA鏈的3ˊ-羥基對新進來的核苷三磷酸的α-磷進行親核攻擊，這一核苷酸基轉移反應的結果是一個新的磷酸二酯鍵的形成和釋放出焦磷酸，焦磷酸水解為無機磷酸釋放能量保證了反應的進行。當開始延伸后，

亞基立刻從RNA聚合酶上脫落。隨著RNA的延伸，已合成的RNA鏈離開模板，原來解旋的DNA又恢復雙螺旋。DNA雙鏈解旋時會使延伸泡前面產生扭曲應力，拓撲異構酶會防止扭曲應力的凈增加。（b）鏈延伸是一個核苷?；D移反應8

RNA聚合酶催化的延伸反應RNA聚合酶9轉錄延伸編碼鏈模板鏈轉錄翻譯轉錄的RNA轉錄延伸編碼鏈模板鏈轉錄翻譯轉錄的RNA10（c）轉錄終止在特殊的終止子序列

在大腸桿菌中存在著兩種終止機制，一種是蛋白依賴性的鏈終止，即一個終止蛋白

與RNA聚合酶復合體相互作用恰好終止在一個發(fā)卡環(huán)處，發(fā)卡環(huán)是在新合成的轉錄鏈上形成的。蛋白

是一個ATP依賴性的RNA-DNA解旋酶，其功能是破壞了RNA-DNA雜化體，導致延伸復合體的解離，使合成的RNA鏈釋放出來。

（c）轉錄終止在特殊的終止子序列11蛋白依賴性的鏈終止蛋白沿著mRNA移動當聚合酶停止在終止位置時，蛋白與酶結合蛋白與酶作用，新合成mRNA釋放終止位置RNA聚合酶蛋白

蛋白依賴性的鏈終止蛋白沿著mRNA移動當聚合酶停止在終止位12另一種是蛋白非依賴性的終止作用，其特征是也有一個類似的發(fā)卡結構，發(fā)卡下游處的模板鏈上恰好存在一串腺苷酸，對應的轉錄鏈應是一串尿苷酸。所以轉錄終止也許是當延伸復合體停止在發(fā)卡結構處時，使得A-U配對堿基的RNA-DNA雜化體不穩(wěn)定，導致復合體的解體而終止轉錄。轉錄形成發(fā)卡環(huán)DNA中模板鏈反向重復序列反向重復序列轉錄方向轉錄被轉錄的最后一個堿基另一種是蛋白非依賴性的終止作用，其特征是也有13蛋白依賴性轉錄終止蛋白非依賴性的轉錄終止蛋白依賴性轉錄終止蛋白非依賴性的轉錄終止1436.3一些抗生素是RNA合成的抑制劑

放線菌素D來自鏈霉菌，可以嵌入雙鏈DNA中。放線菌素D中的吩惡嗪酮環(huán)插入到相鄰的G-C堿基對之間，結構中的環(huán)狀多肽占據了DNA雙螺旋的空間，阻塞了轉錄的延伸。即使在很低的濃度下，放線菌素D都能有效地抑制原核生物和真核生物轉錄的延伸過程。利福霉素是另一個非常有用的抗生素，也是從鏈霉菌分離出來的。利福霉素通過直接與細菌中的RNA聚合酶的

亞基結合來抑制RNA合成，特異地抑制第一個磷酸二酯鍵的形成。由于利福霉素不抑制真核生物的RNA聚合酶，所以一個合成的利福霉素衍生物利福平已用作為臨床的抗結核菌藥。36.3一些抗生素是RNA合成的抑制劑15

放線菌素D放線菌素D1636.4初始RNA轉錄產物都需經轉錄后加工1、初始mRNA轉錄產物的加工初始mRNA轉錄產物要經過在其5ˊ端加一個甲基化的“帽子”和在3ˊ端加上一個多聚腺苷酸的尾巴，并且要切去內含子，將外顯子拼接在一起構成一個功能性的mRNA。

大多數真核生物中編碼蛋白質的基因是由編碼蛋白質氨基酸序列的外顯子和散布在外顯子中非編碼序列的內含子構成的，即外顯子被非編碼序列內含子隔開，所以真核生物基因又稱之為斷裂基因。剛轉錄出的RNA產物，也稱為非均一RNA（hnRNA）必須通過一種稱之RNA剪接機制進行加工。細菌基因的編碼序列是連續(xù)的，轉錄后的mRNA不需加工就可直接作為模板翻譯蛋白質。36.4初始RNA轉錄產物都需經轉錄后加工17通過成熟RNA-DNA雜交給出了雞卵清蛋白的非編碼序列（內含子）灰色表示非編碼序列（內含子）藍色表示編碼序列（外顯子）綠色表示成熟mRNA通過成熟RNA-DNA雜交給出了雞卵清蛋白的非編碼序列（內含18真核生物mRNA的5ˊ端有一個“帽子”結構，是由稀有的7-甲基鳥嘌呤通過5ˊ,5ˊ－三磷酸鍵與初始轉錄物的起始（5ˊ）核苷酸連接形成的。這個帽子是在轉錄到20個核苷酸時在轉鳥嘌呤核苷酸酶催化下加到5ˊ端的。mRNA上的5ˊ帽子對于蛋白質合成的起始是很重要的，同時它可保護mRNA轉錄本不被核酸外切酶降解。真核生物mRNA的5ˊ端有一個“帽子”結構，是由19

真核生物的mRNA的3ˊ端是通過涉及一個大的蛋白復合物的兩步反應進行轉錄后修飾的。在第一步反應中，一個聚腺苷酸化作用斷裂特異因子（CPSF）識別并結合出現于大多數mRNA的3ˊ端的AAUAA序列。另一個稱為斷裂刺激因子（CSTF）的蛋白復合物與CPSF相互作用激活mRNA在AAUAA下游大約20個核苷酸的部位斷裂。在第二步3ˊ加工反應中，聚腺苷酸聚合酶（PAP）結合于轉錄產物的游離的3ˊ端，加上大約20個腺苷酸的3ˊ端的poly（A）尾巴，這個短的尾巴通過寡聚腺苷酸結合蛋白刺激PAP活性再進一步延伸到大約200個腺苷酸。聚腺苷酸化反應是一個重要的調節(jié)步驟，因為聚腺苷酸尾巴的長度能調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。真核生物的mRNA的3ˊ端是通過涉及一個20真核生物mRNA3ˊ端的聚腺苷酸化真核生物mRNA3ˊ端的聚腺苷酸化21hnRNA加工成mRNA的過程外顯子1外顯子2外顯子3內含子5’末端加帽和轉錄終止3’末端剪切和聚腺苷酸化剪去內含子并拼接向細胞質轉運hnRNA加工成mRNA的過程外顯子1外顯子2外22一些小核RNA和輔助蛋白形成核內核糖核蛋白（snRNP）識別剪接位點和參與剪接。在第一次轉酯基反應中，內含子中的一個腺苷酸2ˊ羥基和同一內含子中5ˊ核苷酸之間形成一個不常見的2ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵。在第二次轉酯基反應中，上游外顯子的3ˊ羥基攻擊處于下游的外顯子－內含子邊界的5ˊ磷酸。這一拼接反應涉及稱之套索的一個中間體結構的形成，它是第二次轉酯基反應之后釋放出來的。套索中的2ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵位于稱之分支點的部位，這個部位形成了一個帶有3個磷酸二酯鍵的結構，即腺苷酸殘基與內含子的其余部分是通過標準的3ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵連接的。大多數初始mRNA剪接涉及到兩步轉酯基反應一些小核RNA和輔助蛋白形成核內核糖核蛋白（23

內含子外顯子1外顯子2剪接點內含子外顯子1外顯子2外顯子2外顯子13

剪接部位5

剪接部位內含子外顯子1外顯子2剪接點內含子外242、初始rRNA加工

大腸桿菌中在單一的轉錄本內就含有7個rRNA基因的拷貝。初級轉錄物大約含有6500個核苷酸，編碼23S和16SrRNA，同時還編碼著幾種tRNA和小的5SrRNA。分子克隆和核酸測序表明，23SrRNA大約含有2900核苷酸，而16SrRNA大約含有1600核苷酸。將初始轉錄物加工成23SrRNA和16SrRNA需要特異的核酸酶（RNases）催化。下圖給出了把人的45SrRNA加工成28S和18S兩個有功能的rRNA的加工過程的示意圖。2、初始rRNA加工25

將人45SrRNA加工成28S和18S兩個有功能的rRNA的過程將人45SrRNA加工成28S26

1.RNase通過tRNA剪接反應除去內含子。2.對某些tRNA通過核苷酸基轉移酶加上末端CCA序列。3.進行特異堿基修飾。3、tRNA的加工1.RNase通過tRNA剪接反應除去內含子。3、tR27反密碼子加氨基酸部位加工反密碼子加氨基酸部位加工28

1981年Cech發(fā)現四膜蟲rRNA內含子的切除和外顯子的拼接不需要酶催化，而是一個RNA自我拼接的過程。具有催化功能的RNA分子稱為核酶。36.5核酶是個位置特異的核酸內切酶剪接過程：1、外部的鳥苷與內含子的5ˊ核苷酸形成新的磷酸二酯鍵，釋放出外顯子1的3ˊOH。2、出外顯子1的3ˊOH攻擊外顯子2的5ˊ磷酸，形成磷酸二酯健，將兩個外顯子連接在一起。3、內含子去除5ˊ端片段后形成環(huán)狀。外顯子1外顯子2內含子1981年Cech發(fā)現四膜蟲rRNA內含子的2936.6基因轉錄調控－操縱子學說一個基因指的是編碼蛋白質多肽鏈和功能RNA的DNA（某些病毒基因為RNA），基因表達就是遺傳信息杜轉錄和翻譯過程?；虮磉_的調控可以在不同水平，例如轉錄水平，或翻譯水平上進行。原核生物的基因調控主要是在轉錄水平上進行，因為他們的轉錄和翻譯過程可同時進行。真核生物的轉錄和翻譯過程在時間和空間上都被分隔開，而且轉錄和翻譯后都要經過復雜的加工過程，所以其基因調控在不同水平都需要進行調控。36.6基因轉錄調控－操縱子學說一個基因指30Jacob和Monod在對大腸桿菌乳糖發(fā)酵過程中酶的生物合成研究時，探討了基因表達調控機制，并提出了乳糖操縱子模型。操縱子：由一個啟動子共轉錄的幾個不同基因組成的轉錄單位，即由啟動子序列、操縱基因和受操縱基因調控的一個或多個相關基因（結構基因）組成的基因表達單位。操縱子模型可以很好說明原核生物基因表達的調控機制。調節(jié)物基因控制部位幾個相關基因（結構基因）操縱子的一般結構Jacob和Monod在對大腸桿菌乳糖發(fā)酵過程中酶的生物合成31大腸桿菌乳糖操縱子

大腸桿菌乳糖操縱子包括依次排列的啟動子、操縱基因和三個結構基因。結構基因Z編碼分解乳糖的-半乳糖苷酶、Y編碼吸收乳糖的-半乳糖苷透性酶、a編碼-半乳糖苷乙?；D移酶。O代表操縱基因，i代表調節(jié)基因，P代表啟動子。如果進行轉錄，轉錄產物是一條多順反子mRNA。大腸桿菌能夠利用乳糖作為它的唯一碳源，但需要合成代謝乳糖的三個酶：-半乳糖苷酶（降解乳糖生成半乳糖和葡萄糖）、-半乳糖苷透性酶（使乳糖進入細胞內）、-半乳糖苷乙?；D移酶（半乳糖代謝時需要的酶）。這三個酶都是乳糖存在時誘導生成的酶。乳糖操縱子大腸桿菌乳糖操縱子乳糖操縱子32

當細胞中沒有乳糖或其他誘導物時，調節(jié)物基因經轉錄、表達生成阻遏物，然后阻遏物特異與操縱基因結合，阻止z、y、a基因的轉錄。阻遏物阻遏物與操縱基因結合，阻止z、y、a基因轉錄當細胞中沒有乳糖或其他誘導物33當細胞中存在乳糖或其他誘導物時，誘導物與阻遏物結合，使阻遏物構象發(fā)生變化，從而使阻遏物不能與操縱基因結合。這種狀況下，在RNA聚合酶催化下可以進行z、y、a基因的轉錄。誘導物當細胞中存在乳糖或其他誘導物時，誘導物與阻遏34要點歸納

1.RNA合成需要DNA依賴性的RNA聚合酶全酶，E.coliRNA聚合酶全酶亞基組成為αβ2βˊσ，其中的σ亞基在轉錄起始時被用來識別啟動子，該酶的核心酶亞基組成為αβ2βˊ。真核生物的細胞核中存在3種不同的RNA聚合酶：RNApolⅠ負責合成rRNA前體，而RNApolⅡ負責合成mRNA前體，RNApolⅢ負責合成tRNA前體。2.RNA聚合酶催化以DNA模板鏈為模板轉錄生成互補的、反平行的RNA，用的底物是核糖核苷三磷酸，不需要引物。RNA聚合酶催化3′羥基與核苷三磷酸的5′-α-磷酸基團形成磷酸二酯鍵，使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸鏈中，同時釋放出焦磷酸，焦磷酸水解釋放的能量驅動聚合反應。RNA合成方向是5′→3′方向。另外RNA聚合酶不具有校正核酸酶活性。要點歸納1.RNA合成需要DNA依賴性的RNA聚合酶全35

3.轉錄包括3個階段：起始、延伸和終止。在原核生物中（如E.coli），當σ亞基與RNA聚合酶的核心酶結合形成全酶后附著在DNA的啟動子區(qū)時，轉錄起始。然后通過自啟作用結合ATP（GTP），ATP（GTP）提供3′-羥基用于第二個核苷酸的聚合，即RNA合成不需要預先存在的引物。啟動轉錄開始合成新鏈后，σ亞基從全酶上解離。4.當轉錄進行時，DNA局部解旋，形成所謂的轉錄泡，轉錄泡以每秒50個核苷酸的速度沿著DNA模板移動。新合成的RNA鏈含有結束轉錄的終止信號。一種終止信號是一個RNA發(fā)卡，該發(fā)卡