細(xì)胞傳代培養(yǎng)

1細(xì)胞傳代準(zhǔn)備工作1.1細(xì)胞傳代所需培養(yǎng)液及試劑需提前放置于生物安全柜內(nèi)預(yù)熱至室溫備用。1.2細(xì)胞傳代材料，滴管、移液管、培養(yǎng)器皿、計(jì)數(shù)板、橡皮乳頭。2細(xì)胞傳代步驟2.1人無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。2.2細(xì)胞傳代前先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)觀察。2.3打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面30min左右，關(guān)閉超凈工作臺的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。2.4超凈工作臺面應(yīng)整潔，用75%酒精溶液擦凈。2.5貼壁細(xì)胞的傳代2.5.1貼壁細(xì)胞用滴管或移液管吸去培養(yǎng)器皿中的舊培養(yǎng)液。2.5.2酌情可用2?3mL0.02%EDTA溶液洗去殘留的舊培養(yǎng)基。2.5.3以25ml培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。2.5.4在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓或細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終至消化。2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)液，終至消化。2.5.6用彎頭滴管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，形成細(xì)胞懸液。2.5.7計(jì)數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液（7?10ml/大瓶,3?5mL/小瓶）制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。2.6半懸浮細(xì)胞及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的傳代2.6.1半懸浮細(xì)胞先用滴管將細(xì)胞輕輕吹下來，把細(xì)胞懸浮液加入離心管離心（800?1000rpm,5min）,倒掉上清液。2.6.2把細(xì)胞沉淀制成懸液，計(jì)數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液移到培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。2.6.3懸浮細(xì)胞直接用滴管或移液管吸入離心管離心（800?1000rpm,5min），倒掉上清液。2.6.4把細(xì)胞沉淀制成懸液，計(jì)數(shù)，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)液移到培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。2.6.5將培養(yǎng)器皿放回CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（培養(yǎng)瓶培養(yǎng)需將瓶蓋旋開半圈）。2.6.6操作完畢，填寫"細(xì)胞培養(yǎng)傳代記錄"。3注意事項(xiàng)3.1傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。3.2每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。3.3細(xì)胞培養(yǎng)傳代吹打要輕柔不用用力過猛同時盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都對細(xì)胞有損傷

一?傳代前準(zhǔn)備：1?預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37°C水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2?用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3?正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4?點(diǎn)燃酒精燈，注意火焰不能太小。5?準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。6?取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。7?從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。8?打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。9稍微搖搖，然后從對側(cè)倒掉培養(yǎng)液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精燈。二?胰蛋白酶消化；1?加入消化液：用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37Co2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度，然后讓其停止消化。3?倒掉消化液加入培養(yǎng)液，棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液。注意要在對測加入培養(yǎng)液。三?吹打分散細(xì)胞：1?吹打制懸：用吸管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2?吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。3?平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。4?棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。四?分裝稀釋細(xì)胞：1?分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2?顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5x105/ml，最后要做好標(biāo)記。五?傳代培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時為一個+，占50%為++,占75%時為+++。六傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：1?嚴(yán)格的無菌操作2?適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附:0.25%胰酶（胰蛋白酶，Trypsin）配方：100mlPBS,0.25g胰酶步驟：1先配100mlPBS。2稱胰酶0.25g。3加入PBS中，低速攪拌。4調(diào)PH7.4。5過濾，分裝，-20°C保存，4°C短期內(nèi)用完。注意：低速很重要，機(jī)械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫，酶就變性了。低溫，防止酶失活；對難消化的細(xì)胞，在上述配方中，加入0.02g的EDTA（0.02%）新手細(xì)胞傳代培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)用品：75%酒精，酒精棉球，酒精燈，火柴，離心管CL5ml），離心機(jī)，吸管，膠帽，倒置顯微鏡，超凈工作臺，二氧化碳培養(yǎng)箱，25ml培養(yǎng)瓶（5個），培養(yǎng)瓶蓋，大燒杯，鑷子，D-Hanks液，胰酶（0.25%）,RP1640培養(yǎng)基，小牛血清，濾膜，注射器，24孔板，計(jì)數(shù)板，蓋玻片，記號筆，中性筆，白紙。實(shí)驗(yàn)用品處理：1、 超凈工作臺：用75%酒精擦拭，放入2中所列物品后40分鐘紫外照射。2、 二氧化碳培養(yǎng)箱：將內(nèi)部托盤，托板，橫架，豎架全部拆出來，75%酒精擦拭，放入超凈臺照射40分鐘。箱內(nèi)部用75%酒精擦拭，托盤內(nèi)的水為蒸餾水1L加5克硫酸銅。3、 75%酒精，酒精棉球，酒精燈，火柴，大燒杯，濾膜，注射器，24孔板計(jì)數(shù)板（75%酒精擦拭后），蓋玻片，記號筆，中性筆，白紙放到超凈工作臺內(nèi)紫外照射40分鐘。4、 離心管，膠帽，培養(yǎng)瓶蓋115攝氏度高壓15分鐘，70攝氏度烘箱烤干。D-hanks液115攝氏度高壓15分鐘，放入超凈臺中。D-hanks工作液用前過濾。5、 培養(yǎng)瓶，鑷子，吸管，121攝氏度高壓20分鐘，70攝氏度烘干。6、 RP-1640培養(yǎng)基先分裝，90ml每瓶，然后使用之前75%酒精擦拭外表面，在二氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)熱到37攝氏度。7、 胰酶從-20攝氏度拿到4攝氏度融化,，然后放到二氧化碳培養(yǎng)箱中幾分鐘，使溫度達(dá)到最佳工作溫度，胰酶用前過濾。8、 小牛血清10ml放到4攝氏度融化，然后加入到90ml培養(yǎng)基中，混勻，韓小牛血清培養(yǎng)基用前過濾。9、 離心機(jī)，倒置顯微鏡用75%酒精仔細(xì)擦拭，紫外照射40分鐘。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：1、 倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。（倒到大燒杯中，小心不要接觸）2、 向25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加入lml胰酶消化液，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后倒掉消化液后再加1-2ml新的消化液，輕輕搖動后，再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。（用吸管加消化液）3、 在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞間間隙增大時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。（用吸管加培養(yǎng)基）4、 用吸管吸去培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁，制備細(xì)胞懸液。吹打的部位應(yīng)均勻，可按從上打下，從左到右的順序進(jìn)行，保證瓶底各個部位的細(xì)胞均能被吹到，此外吹打時不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。5、 將吹打后的細(xì)胞治愈倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)原貼壁細(xì)胞均已懸浮于培養(yǎng)液中，成片的細(xì)胞已分散成小的細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，即可