解脲支原體活性機(jī)制的研究

解脲支原體活性機(jī)制的研究

近年來(lái)，由于使用抗生素的廣泛使用和不適當(dāng)?shù)膭┝?，如交沙霉素、二羥色胺、丙烯酸酯、吉帕霉素、氯霉素、血紅蛋白、氯霉素等，臨床分離服藥支架（uu14）的數(shù)量正在增加，服藥菌的繼續(xù)發(fā)展和反復(fù)感染，這給控制ngv帶來(lái)了困難，現(xiàn)在是治療內(nèi)臟器官僚主義者的難題。中西藥聯(lián)合用藥將是臨床用藥的一種趨勢(shì)。為此,篩選出對(duì)Uu14敏感性較強(qiáng)的復(fù)方制劑,旨在探討中藥有效成分對(duì)Uu14的抑制效果,并期待下一步揭示出其活性機(jī)制的研究狀況。1數(shù)據(jù)和方法1.1解哌受體培養(yǎng)基①中藥:苦參、白花蛇舌草、黃芩(吉林省藥材公司)100%濃度水煎劑,相當(dāng)于每毫升含2克生藥。黃芩甙(baicalin中國(guó)藥品生物制品檢定所)以吐溫-80配制成30mg/ml原液備用。②解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株:Uu14血清型解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株由首都兒科研究所細(xì)菌室提供。③解脲支原體培養(yǎng)基:PPLObroth2.10g,25%新鮮酵母浸液10ml,20%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(56℃滅活,去除支原體),0.002%酚紅,0.2%尿素。pH值調(diào)至6.0。若制備半固體解脲支原體培養(yǎng)基,則加入0.7%瓊脂粉,高壓滅菌后備用。酵母浸液、胎牛血清、尿素過(guò)濾除菌后加入培養(yǎng)基中。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.12支架的生長(zhǎng)和顏色變化單位按照RobersonJA,1987年文獻(xiàn)方法。1.2.2中藥復(fù)方制劑的mic測(cè)定按照KennyGE,1986年文獻(xiàn)方法略加改進(jìn)。1.2.3藥物稀釋度的測(cè)定將Uu14血清型解脲支原體標(biāo)準(zhǔn)株連續(xù)傳代三次,取第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物(1×106CCU/ml),以PPLO肉湯稀釋至8×104CCU/ml備用。方法一,液體培養(yǎng)基稀釋法:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,第1孔加入PPLO肉湯培養(yǎng)基150μl,第12孔加入200μl,第3~11孔加入50μl。其次,向第2、3孔中加入中藥復(fù)方制劑50μl。然后,從第3孔開(kāi)始倍比稀釋復(fù)方藥物至第11孔。用微量移液器在各孔中吹打藥液10次后,將其混勻吸至下一孔,直至第11孔。對(duì)照藥物單體黃芩甙的稀釋方法同樣進(jìn)行。第11孔稀釋完畢,從中吸出50μl丟棄。最后以PPLO肉湯補(bǔ)足2~11孔內(nèi)的培養(yǎng)基量,每孔100μl。由此,黃芩甙在第2~11孔中,10個(gè)稀釋度的藥物濃度分別是30mg/ml……0.058mg/ml;復(fù)方藥物水煎劑2~11孔的稀釋濃度為500mg/ml……0.48mg/ml。分別向第1~11孔加入50μl的8×104CCU/ml解脲支原體培養(yǎng)物。至此,所有孔中的液體體積均為200μl(Uu14數(shù)量為2×104CCU/ml)。第1孔為Uu14陽(yáng)性對(duì)照孔,第12孔為陰性對(duì)照孔。加樣完畢后蓋上板蓋,充分震蕩后置于濕盒內(nèi),37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后觀察結(jié)果。在第1孔(陽(yáng)性對(duì)照)培養(yǎng)基發(fā)生顏色改變后,便可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定藥物的最小抑制濃度。以最高稀釋倍數(shù),無(wú)顏色變化孔的藥物濃度為最小抑制濃度,即MIC值。方法二,半固體瓊脂對(duì)倍稀釋法:制備含有不同稀釋度藥物的培養(yǎng)基平板,每種藥物首先以PPLO肉湯制備出10個(gè)稀釋度的藥液。黃芩甙10個(gè)稀釋度藥液濃度分別為60mg/ml……0.11mg/ml,復(fù)方藥物水煎劑10個(gè)稀釋度藥液濃度為500mg/ml……0.97mg/ml。其次,于直徑7.5cm玻璃無(wú)菌平皿中加入不同稀釋度的藥液0.75ml,每個(gè)稀釋度藥液設(shè)置3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)平皿。然后注入已經(jīng)融化冷卻至45℃的半固體瓊脂培養(yǎng)基7.5ml,立即旋轉(zhuǎn)混勻,待凝固后每板藥物培養(yǎng)基接種100μl的1×103CCU/ml解脲支原體培養(yǎng)物(1×106CCU/ml,稀釋1000倍),劃線涂布于整個(gè)培養(yǎng)基表面。翻轉(zhuǎn)平板后,置37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48h,取出后在低倍顯微鏡下觀察解脲支原體生長(zhǎng)的情況。以未見(jiàn)到Uu14生長(zhǎng)的藥物稀釋度為最低抑制濃度,即MIC值。2液體培養(yǎng)稀釋法與倍稀釋法mic檢測(cè)結(jié)果比較體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中藥復(fù)方制劑對(duì)解脲支原體(Uu14)有抑制作用,MIC檢測(cè)結(jié)果其敏感程度為中度敏感。比較兩種實(shí)驗(yàn)方法,液體培養(yǎng)稀釋法的MIC值高出半固體瓊脂對(duì)倍稀釋法MIC值2個(gè)稀釋度。結(jié)果見(jiàn)附表。3影響解哌抗體感染的因素解脲支原體是性傳播疾病的重要病原體之一,它可侵犯女性尿道、宮頸及前庭大腺,引起尿道炎、宮頸炎與前庭大腺炎;上行感染時(shí),可引起子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、輸卵管炎,尤其以輸卵管炎多見(jiàn)。由于女性生殖器官受解脲支原體的感染,從而導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、不孕及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩。有資料提示,不孕癥夫婦的宮頸粘液、精液中解脲支原體培養(yǎng)陽(yáng)性率高達(dá)50%以上,解脲支原體感染與不孕癥的發(fā)生有相關(guān)關(guān)系。解脲支原體感染造成不良的另一個(gè)原因是流產(chǎn),有人從流產(chǎn)的組織中檢出解脲支原體的陽(yáng)性率高達(dá)40%以上。因此,對(duì)不明原因的流產(chǎn),尤其是多次流產(chǎn)者,應(yīng)考慮有解脲支原體感染的可能。解脲支原體感染造成的不完全梗阻的輸卵管炎性粘連,可使管腔狹窄,通而不暢,還是發(fā)生宮外孕的重要原因。按照KennyGE的實(shí)驗(yàn)方法,測(cè)定了中藥復(fù)方制劑對(duì)Uu14的MIC值,并與單體黃芩甙進(jìn)行對(duì)比觀察。結(jié)果表明,復(fù)方藥物對(duì)Uu14的敏感性為中度敏感,MIC在3.75~7.81mg/ml范圍之間。即在MIC<7.81mg/ml時(shí),培養(yǎng)基中有Uu14生長(zhǎng);MIC>3.75mg/ml時(shí),培養(yǎng)基中則沒(méi)有Uu14生長(zhǎng)。液體培養(yǎng)基稀釋法的MIC值要比半固體瓊脂對(duì)倍稀釋法高出2個(gè)稀釋濃度的數(shù)值,原因是瓊脂載體等物質(zhì)有限制藥液擴(kuò)散的作用。盡管兩種實(shí)驗(yàn)方法出現(xiàn)2個(gè)MIC值,但是排除掉干擾因素,中藥復(fù)方制劑MIC值還是能夠確定的。與黃芩甙對(duì)比觀察,黃芩甙對(duì)Uu14的敏感程度較高。能否可以這樣說(shuō),中藥復(fù)方制劑對(duì)Uu14的抑制作用,主要是通過(guò)其中黃芩抑制Uu14的DNA復(fù)制過(guò)程,破壞掉某一程序完成的。但其復(fù)方制劑中幾味中