倍硫磷與小牛胸腺dna的相互作用

倍硫磷與小牛胸腺dna的相互作用

農(nóng)業(yè)使用農(nóng)藥對(duì)農(nóng)業(yè)具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，但其副作用也越來(lái)越嚴(yán)重。特別是農(nóng)業(yè)污染，通過(guò)生物固定化和食物鏈進(jìn)入人體，農(nóng)藥殘留在人體中，導(dǎo)致各種組織和器官疾病，甚至致力于疾病和突變。殘留農(nóng)藥問(wèn)題已成為當(dāng)前食品安全的主要問(wèn)題之一。DNA是生物體內(nèi)主要的遺傳物質(zhì),也是化學(xué)物質(zhì)作用于生物體早期階段的一個(gè)重要的靶標(biāo)。化學(xué)物質(zhì)與DNA之間的相互作用模式主要有嵌插結(jié)合、溝區(qū)結(jié)合和靜電結(jié)合,其中嵌插結(jié)合是形成DNA加合物最主要的模式,DNA加合物的形成一旦逃避生物自身的修復(fù),就可成為致突變或致癌的最小因子而被認(rèn)為是致腫瘤過(guò)程的一個(gè)重要起始階段。事實(shí)證明,在體內(nèi)與DNA發(fā)生作用的化學(xué)物質(zhì)都能在一定程度上在體外與DNA發(fā)生作用。倍硫磷(fenthion,FEN,結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)是一種高效、廣譜的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑,適用于防治水稻、蔬菜和果樹(shù)等的多種害蟲(chóng),對(duì)螨類(lèi)也有效。本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法、紫外-可見(jiàn)光譜法、黏度測(cè)定和鹽效應(yīng)等方法,研究倍硫磷與體外小牛胸腺DNA的結(jié)合模式,旨在為深入研究農(nóng)藥的致癌、致突變的分子生物學(xué)機(jī)理,為農(nóng)藥中毒的救治和高效低毒農(nóng)藥的設(shè)計(jì)與篩選提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1不同溶液配制倍硫磷(分析純,Dr.EhrenstorferGmbH公司產(chǎn)品)用無(wú)水甲醇配制成濃度為2.336×10-3mol/L的溶液,使用時(shí)根據(jù)所需進(jìn)行稀釋;小牛胸腺DNA(北京華美生物工程有限公司產(chǎn)品)用0.1mol/L的NaCl溶液溶解,濃度利用ε260=6600L/mol·cm來(lái)確定,溶液保存于4℃的冰箱中備用;溴化乙錠(EB,Sigma公司產(chǎn)品)配制成1.0×10-3mol/L的水溶液,使用時(shí)根據(jù)所需進(jìn)行稀釋;pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液;1.0mol/L的KI溶液;4.0mol/L的NaCl溶液;1.0mol/L的NaH2PO4溶液;試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。F-4500型熒光光度計(jì)日本日立公司;UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司;PHS-3C型酸度計(jì)上海雷磁儀器廠(chǎng)。1.2熒光光譜測(cè)定在10ml的比色管中,加入2.0mlTris-HCl緩沖溶液和40μl2.336×10-3mol/L倍硫磷溶液,用二次蒸餾水定容至5ml,混勻。準(zhǔn)確移取3.0ml該溶液于比色皿中,掃描其熒光光譜后再逐漸加入濃度為1.350×10-3mol/LDNA溶液(8μl/次),混合均勻,放置6min后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。在10ml的比色管中,加入2.0mlTris-HCl緩沖溶液,15μl1×10-3mol/LEB溶液和67μl1.350×10-3mol/LDNA溶液,用二次蒸餾水定容至5ml,混勻。準(zhǔn)確移取3.0ml該溶液于比色皿中,掃描其熒光光譜后再逐漸加入濃度為2.336×10-3mol/L倍硫磷溶液(8μl/次),混合均勻,放置6min后進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。2結(jié)果與分析2.1dna對(duì)倍硫磷熒光強(qiáng)度的影響在pH7.4的Tris-HCl緩沖條件下,測(cè)定了2.71×10-5mol/LDNA的紫外吸收曲線(xiàn)(圖2曲線(xiàn)c)和倍硫磷與DNA等摩爾混合物與倍硫磷的差譜(圖2曲線(xiàn)d)。發(fā)現(xiàn)曲線(xiàn)c與曲線(xiàn)d有明顯的差別,說(shuō)明倍硫磷和DNA之間發(fā)生了相互作用。由圖3可知,在pH7.4Tris-HCl緩沖溶液中,倍硫磷具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光,隨著DNA加入濃度的增大,倍硫磷的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的猝滅,表明倍硫磷與DNA發(fā)生了相互作用,DNA對(duì)倍硫磷的熒光產(chǎn)生了猝滅效應(yīng)。當(dāng)小分子與DNA任一位點(diǎn)發(fā)生作用時(shí),體系中發(fā)生作用的小分子與未發(fā)生作用的小分子之間處于一種平衡狀態(tài),這種平衡關(guān)系可以用以下方程描述:lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q],式中:F0和F分別為猝滅劑加入前和加入后體系的熒光強(qiáng)度值;[Q]為猝滅劑DNA的濃度;K為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得到線(xiàn)性方程y=0.958x+4.056,r=0.9980,由該直線(xiàn)的截距和斜率求得倍硫磷與DNA間的結(jié)合常數(shù)K=1.14×104L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=0.958。2.2倍硫磷嵌插方式對(duì)dna-eb復(fù)合體系的影響事實(shí)證明EB是一種典型的嵌入式熒光探針,它本身的熒光強(qiáng)度很弱,但平行地嵌入雙螺旋DNA的堿基對(duì)中使熒光顯著增強(qiáng)。如果倍硫磷以嵌插方式與DNA作用,那么在DNA-EB復(fù)合物中加入倍硫磷后,倍硫磷會(huì)與EB發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用,置換出與DNA結(jié)合的EB而使DNA-EB復(fù)合物的熒光強(qiáng)度下降。但由圖4中可見(jiàn),DNA-EB復(fù)合物的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯的降低,初步推斷倍硫磷與DNA的結(jié)合不是嵌插結(jié)合。2.3dna黏度隨堿基的變化在缺乏晶體結(jié)構(gòu)資料的情況下,黏度測(cè)定一般被認(rèn)為是檢測(cè)化合物與DNA鍵合模式最有力的證據(jù)之一。當(dāng)化合物以嵌插模式與DNA作用時(shí),DNA的相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)變大以容納插入配體,結(jié)果使DNA的雙螺旋伸長(zhǎng),導(dǎo)致DNA黏度的增大;而以靜電或溝區(qū)模式結(jié)合,DNA的黏度無(wú)明顯變化。由圖5可見(jiàn),室溫下隨著倍硫磷濃度的逐漸增大DNA的相對(duì)黏度幾乎不變(η和η0分別為倍硫磷存在和不存在下DNA的黏度),進(jìn)一步證實(shí)倍硫磷與DNA之間不存在嵌插作用。2.4倍硫磷與dna的熒光強(qiáng)度由于Na+等鹽類(lèi)陽(yáng)離子能中和DNA上帶負(fù)電荷的磷氧基,如果倍硫磷與DNA的相互作用模式為靜電作用,隨著離子強(qiáng)度的增加,DNA表面被一層帶正電的Na+包圍,使倍硫磷不易接近DNA分子,減少了與DNA的作用,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。由圖6可見(jiàn),隨著NaCl的加入,倍硫磷和倍硫磷-DNA體系的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化,由此推斷倍硫磷與DNA之間不是靜電結(jié)合。如果倍硫磷能與DNA的磷酸骨架發(fā)生靜電結(jié)合,那么在倍硫磷-DNA體系中加入NaH2PO4后,由于NaH2PO4中的磷酸基會(huì)阻礙倍硫磷與DNA骨架上的磷酸根結(jié)合,DNA對(duì)倍硫磷的熒光猝滅效應(yīng)減弱,即倍硫磷-DNA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。但圖7顯示復(fù)合物的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有變化,這再次證明倍硫磷與DNA間的結(jié)合方式不是靜電結(jié)合。2.5熒光u-響應(yīng)面為小分子I-是動(dòng)態(tài)猝滅劑,通過(guò)考察其對(duì)小分子熒光的猝滅作用可以判斷小分子與DNA的作用方式。當(dāng)小分子以嵌插方式與DNA結(jié)合,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的堿基和帶負(fù)電的磷酸骨架會(huì)使陰離子猝滅劑難于接近嵌插結(jié)合的小分子,使I-猝滅作用減弱。當(dāng)小分子以溝區(qū)模式與DNA結(jié)合時(shí),DNA的加入使I-對(duì)小分子熒光猝滅效應(yīng)增強(qiáng)。圖8為用Stern-Volmer方程處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸的結(jié)果。線(xiàn)性方程A(y=159.72x+1.075,r=0.9958);B方程(y=109.77x+1.016,r=0.9972)分別描述I-對(duì)倍硫磷-DNA和倍硫磷體系的熒光猝滅,由斜率求得猝滅劑I-對(duì)倍硫磷-DNA復(fù)合物和倍硫磷的猝滅常數(shù)分別為159.72L/mol和109.77L/mol。加入DNA后,I-對(duì)倍硫磷熒光的猝滅程度增大,說(shuō)明倍硫磷是以溝區(qū)模式與DNA結(jié)合。3倍硫磷與dna溝區(qū)的相互作用的模式本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用紫外、熒光光譜法并結(jié)合溴化乙錠(EB)熒光探