elisa試驗(yàn)的干擾因素分析

elisa試驗(yàn)的干擾因素分析

1試劑的原因1.1試劑的選擇試劑的選擇是確保血液檢測(cè)質(zhì)量的重要因素。雖然國家采用批批檢定的形式對(duì)ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān),但不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別,要選購知名度相對(duì)高、具有“三證”的試劑,不要用無批號(hào)的試劑,最好選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號(hào)的試劑。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。1.2假陰性法的后果在臨床實(shí)驗(yàn)室,對(duì)試劑的準(zhǔn)備一般不太注意,通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用,而忽略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問題,其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此,在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是,將試劑盒先從冰箱中拿出來,在室溫下放置20～30min后,再進(jìn)行測(cè)定,使試劑盒在使用前與室溫平衡,這樣做的目的是能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度,以滿足后面的測(cè)定需求。2樣本的要素2.1在嚴(yán)重溶血的樣品中，混合紅細(xì)胞的血清容易沉淀和積聚在聚氧菌的孔中不易洗凈,殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性,催化底物顯色造成假陽性,嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。2.2凍融法因此,ELISA檢測(cè)宜采集新鮮標(biāo)本,如不能當(dāng)時(shí)測(cè)定,5d之內(nèi)應(yīng)4℃保存,1周后檢測(cè)應(yīng)低溫凍存;同時(shí),收集標(biāo)本采用無菌試管,可防止標(biāo)本的污染。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果。因此,ELISA檢測(cè)應(yīng)盡量采用新鮮標(biāo)本,長時(shí)間凍存的樣本應(yīng)避免反復(fù)融凍。2.3elisa測(cè)定血清中蛋白原的殘留在工作中,有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測(cè),常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清,使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊或附著在酶標(biāo)板孔壁內(nèi)使酶標(biāo)記物不易洗掉,易造成假陽(陰)性結(jié)果;因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清,或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?控制方法3.1吸仍和吸量的確定加樣要準(zhǔn)確,滴加試劑時(shí)應(yīng)垂直滴加,不得傾斜、人為的加大試劑量。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性,直接影響檢測(cè)結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊,導(dǎo)致清洗困難,加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗,定期校準(zhǔn)。做到一人一移液頭,防止交叉污染。加標(biāo)本應(yīng)加在微孔底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。3.2溫度測(cè)定方法溫育影響,96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別;易產(chǎn)生邊緣效應(yīng),抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求,酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同,造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異,盡可能使用水浴,溫育時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。溫箱溫度必須嚴(yán)格控制。溫育過程中應(yīng)封閉,避免邊緣效應(yīng)。3.3假陽性、假陰性洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié),手洗條件一致性較差,對(duì)結(jié)果影響較大,半自動(dòng)與全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果,血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài),造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底,導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性;洗板機(jī)洗板時(shí)每天進(jìn)行注液量和殘液量的校正,使用完畢后用蒸餾水沖洗。洗滌時(shí)確認(rèn)注滿每個(gè)反應(yīng)孔,洗滌后殘液量不得>2μl,最后將孔內(nèi)液體拍干。為了洗滌效果更好,實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1～2次,或適當(dāng)增加洗板的次數(shù),有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。3.4酶標(biāo)儀測(cè)試終止顯色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程作。顯色終止15min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取,酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光照射下,先預(yù)熱15min～30min再進(jìn)行測(cè)試。肉眼判斷結(jié)果時(shí),顯色淺不易觀察,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,必須使用酶標(biāo)儀檢測(cè),以保結(jié)果一致性。3.5elisa法控制變量的影響因素分析每批測(cè)試均應(yīng)做好質(zhì)控,建立嚴(yán)格的審核制度,對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果判斷是否準(zhǔn)確,可靠有效,異常結(jié)果復(fù)查與臨床醫(yī)生及時(shí)溝通,對(duì)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析處理,找出失控原因及再控經(jīng)驗(yàn)。綜上所述,盡管ELISA法操作簡單,