抗hivg1p120趨化蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)噬菌體fab單克隆抗體的篩選

抗hivg1p120趨化蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)噬菌體fab單克隆抗體的篩選

人類免疫缺陷（hiv）是人類免疫抑制綜合征（ihd）的病原體。感染與日俱增?；加衖hs后，人們通常會死亡。目前，治療藥物和預(yù)防措施沒有找到，給患者和社會帶來巨大的損失。HIV-1感染人體細(xì)胞時(shí),其外膜糖蛋白gp120先結(jié)合CD4,然后構(gòu)型變化,出現(xiàn)結(jié)合共受體的表位,與共受體結(jié)合后導(dǎo)致后繼的一系列過程并致靶細(xì)胞死亡。封閉gp120上與共受體結(jié)合的表位可以阻斷其與共受體結(jié)合從而可以使靶細(xì)胞免受感染。本研究設(shè)計(jì)合成了gp120趨化蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的23肽,并以此為固相抗原從建立的抗HIV-1噬菌體Fab抗體庫篩選出噬菌體Fab單克隆抗體,并對陽性克隆進(jìn)行了鑒定。1材料和方法1.1hiv-1噬菌體fab抗體庫大腸埃希菌菌株TG1和輔助噬菌體M13K07由海軍總醫(yī)院王琰教授提供。HIV-1噬菌體Fab抗體庫由本室構(gòu)建。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等試劑均購自美國Promega公司。1.2肽的合成本室合成,采用美國PE公司431A型自動(dòng)多肽合成儀以固相法合成相應(yīng)于HIV-1gp120417～439位氨基酸殘基的23肽及相應(yīng)于HIV-1gp41584～609位氨基酸殘基的26肽。1.3抗hiv-1gp120多肽噬菌體Fab單克隆抗體的篩選1.3.1tg1菌種的篩選將HIV-1gp12023肽抗原包被酶標(biāo)板,加入噬菌體抗體庫,37℃孵育2h,PBST洗12次,然后加入0.1mol/LpH2.1的甘氨酸-鹽酸洗脫,感染2ml新鮮TG1菌,經(jīng)M13K07感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此重復(fù)6輪,PBST洗滌次數(shù)每輪增加2次。1.3.2單克隆抗體對陽性唾液的影響fab單克隆抗體檢測將第6輪篩選出的噬菌體感染TG1菌后涂板,挑取單克隆菌落,37℃培養(yǎng)過液,然后取少量過夜培養(yǎng)菌,37℃培養(yǎng)2h,M13K07感染后37℃培養(yǎng)過夜,離心,收集上清,即為噬菌體Fab單克隆抗體。hrp-兔抗-m13k06的檢測用HIV-1gp12023肽包被酶標(biāo)板,加入90μl噬菌體Fab單克隆抗體和10μl10%脫脂奶-PBS,37℃孵育2h,洗板,加入HRP-兔抗-M13K07抗體(本室自制),于37℃反應(yīng)1h后,洗板,TMB顯色,測吸光度(A450nm值)。以輔助噬菌體M13K07作陰性對照。以S/N≥2.1為陽性。hrp-兔抗-m13k基層黨組織的構(gòu)建將gp120肽點(diǎn)硝酸纖維素膜,封閉,洗膜,加入陽性克隆,37℃反應(yīng)2h,洗膜后加入HRP-兔抗-M13K07抗體,于37℃反應(yīng)1h后洗膜,以二胺基聯(lián)苯胺顯色。以輔助噬菌體M13K07作陰性對照。1.4單克隆抗體鑒定微生物異體抗體1.4.1血清學(xué)測定s150nm將各陽性克隆加入包被有HIV-1gp120抗原的酶標(biāo)板上,37℃孵育1h,洗板,加入抗-HIVgp12023肽陽性人血清,37℃孵育1h,洗板,加HRP-羊抗人IgG抗體,37℃孵育1h,洗板,TMB顯色,測A450nm值。以輔助噬菌體M13K07作陰性對照,抑制率>50%為陽性,抑制率=(A對照-A樣本)/A對照。1.4.2-1gp1423肽板合成將67號克隆和抗-HIVgp12023肽抗血清同時(shí)加入HIV-1gp12023肽板上,37℃孵育2h,洗板,加HRP-羊抗人IgG抗體,37℃孵育1h,洗板,TMB顯色,測A450nm值。以輔助噬菌體M13K07作陰性對照,抑制率>50%為陽性。1.4.3pge-pge-cmp1,gp113,gp113,3g113,7e將各陽性克隆與HIV-1gp120抗原或HIV-1gp41肽混合,37℃孵育1h后加到gp120抗原板上,37℃孵育2h,洗板,加入HRP-兔抗M13K07抗體,37℃孵育1h,洗板,TMB顯色,測A450nm值。對照孔不加多肽,抑制率>50%為陽性。1.4.4質(zhì)粒提取和酶切鑒定按WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem操作說明書提取各單克隆噬菌體質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定和序列測定。fer,xho,bsa取各單克隆質(zhì)粒,按說明書加入10×buffer,XhoⅠ和XbaⅠ,BSA,補(bǔ)足H2O至20μl,37℃2h。通過1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察DNA片段大小。saagctagctagctagctagctca-3-gamatchg-3采用雙脫氧終止法測定核苷酸序列,Fd段和κ鏈測序引物分別為5′-SAGGTGCAGCT-CGAGSAGTCTGGG-3′和5′-GAMATYGAGCTCACSCAG-TCTCCA-3′,測序結(jié)果和Genbank中序列進(jìn)行比較。2結(jié)果2.1elisa檢測經(jīng)過6輪篩選后在100個(gè)噬菌體Fab單克隆抗體中挑出7個(gè)特異性陽性抗體株(7,38,58,67,73,76和81號),ELISA檢測其A值見表1,其S/N值為2.7～11.7。Dotblot結(jié)果見圖1。2.2單克隆抗體fab的測定2.2.1隔離阻滯試驗(yàn)7個(gè)陽性克隆對抗HIV-1gp12023肽陽性人血清的抑制率為68.18%～79.38%(表2)。2.2.2抗hiv-1gp133肽陽性陽性與gp23肽結(jié)合的抑制率67號Fab單克隆抗體對不同稀釋度抗HIV-1gp12023肽陽性抗血清與gp12023肽結(jié)合的抑制率結(jié)果見表3,抑制率均>50%。2.2.3fab單克隆抗體與包被肽聯(lián)合抑制率比較gp12023肽作為競爭性抗原對7株噬菌體Fab單克隆抗體與包被肽結(jié)合抑制率均≥72.60%,而gp41肽則均≤22.94%(表4)。2.2.4/雙酶切鑒定分別取7,67,76和81號克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切下的2.5kb大小的片段,與包含gⅢ及輕重鏈的全長基因預(yù)計(jì)大小相符(圖2)。2.2.5輕鏈和重鏈fd段將7,67,76和81號克隆基因片段進(jìn)行測序,它們的輕鏈和重鏈Fd段序列相同,將輕鏈和重鏈Fd段序列與Genbank中的序列比較,其重鏈恒定區(qū)(Ch1)屬IgG類、IgG1亞類,輕鏈恒定區(qū)(CL)屬κ型。重鏈可變區(qū)(Vh)屬VhⅢ基因家族,輕鏈可變區(qū)(VL)屬VκⅢ基因家族。3fab單克隆抗體與gp113肽陽性抗血清的競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果Rizzuto等發(fā)現(xiàn),HIV-1gp120外膜糖蛋白的Lys-121,Arg-419,Ile-420,Lys-421,Gln-422,Pro-438和Gly-441是與CCR5結(jié)合有關(guān)的重要氨基酸殘基且高度保守,提示能封閉這些位點(diǎn)的生物工程藥物可以阻斷相應(yīng)HIV-1株gp120與CCR5結(jié)合,從而阻止HIV-1感染靶細(xì)胞。我們合成了含有其中5個(gè)主要位點(diǎn)的23肽,以此為固相抗原,從HIV-1噬菌體Fab抗體庫中篩選獲得了7株抗HIV-1gp120多肽的陽性Fab單克隆抗體。ELISA和Dotblot檢測表明,它們具有較高抗原結(jié)合活性;特異性抗原抑制試驗(yàn)顯示gp12023肽對這7株單克隆抗體有較高抑制率,表明它們有良好的特異性。阻斷抑制試驗(yàn)顯示7個(gè)克隆的抑制率為68.18%～79.38%。由于阻斷抑制試驗(yàn)中噬菌體Fab單克隆抗體先于抗HIV-1gp120肽陽性抗血清與包被的固相抗原結(jié)合,為更好地檢測其抑制作用,我們選擇其中一株67號單克隆進(jìn)行了競爭抑制試驗(yàn),結(jié)果顯示該克隆能抑制抗HIV-1gp120肽陽性抗血清中抗體與gp120肽的結(jié)合,抑制率>50%,表明67號噬菌體Fab單克隆抗體和抗HIV-1gp120肽陽性抗血清與gp120肽的結(jié)合能力相近。我們提取7,67,76和81號克隆的pComb3重組質(zhì)粒,對它們進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果顯示,4個(gè)克隆的重組質(zhì)粒均含有與包含gⅢ與輕重鏈的全長基因預(yù)計(jì)大小相符的DNA片段。測序結(jié)果顯示它們插入的輕重鏈基因序列相同,表明它們可能為同一個(gè)克隆,與部分已報(bào)道的結(jié)果類似?？紤]其可能與下列原因有關(guān):①在供血源的外周血中,雖然抗gp120抗體種類較多,但針對gp120趨化蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的抗體種類較少,而我們用于篩選的gp12023肽的肽鏈較短,且此位點(diǎn)不易暴露而誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生,故抗-gp12023肽的抗體種類更少。②抗-gp12023肽抗體在供血源的外周血可能出現(xiàn)了優(yōu)勢克隆,在擴(kuò)增篩選的過程中,這些克隆由于與gp12023肽的親和力高,易感染細(xì)菌而產(chǎn)生了選擇優(yōu)勢并被放大。③為了保證陽性克隆的特異性,我們篩選了6輪,較一般的3～4輪要多,進(jìn)一步導(dǎo)致了優(yōu)勢克隆的放大。經(jīng)過比較,我們獲得的Fab單克隆抗體基因的重鏈恒定區(qū)(Ch1)屬IgG類、IgG1亞類,輕鏈恒定區(qū)(CL)屬κ型。重鏈可變區(qū)(Vh)屬VhⅢ基因家庭,輕鏈可變區(qū)(VL)屬VκⅢ基因家庭。目前市場上已有的艾滋病藥物,大多針對艾滋病病毒復(fù)制時(shí)所需的蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。而一些能夠阻止病毒與血細(xì)胞