elisa試驗(yàn)的操作要點(diǎn)

elisa試驗(yàn)的操作要點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）是軍隊(duì)血液采集中最常用的檢測(cè)方法之一，但操作中的各個(gè)階段都對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響。主要連接包括：樣品的保存和運(yùn)輸、試劑的使用和維護(hù)、機(jī)器的維護(hù)和維護(hù)；添加樣品、加熱培訓(xùn)、清潔、油漆、顏色和測(cè)量；檢測(cè)結(jié)果的輸入和測(cè)試。由于操作不當(dāng)，試驗(yàn)結(jié)果將影響。只有在這三個(gè)方面，員工才能確保elisa檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保證輸血安全。1檢測(cè)前的質(zhì)量控制1.1elisa試驗(yàn)過(guò)程高質(zhì)量的標(biāo)本是保證ELISA質(zhì)量的前提,所以標(biāo)本的留取必須符合質(zhì)量要求。為了保障標(biāo)本留取的正確,在采血時(shí),貼好標(biāo)簽后一定要重新核對(duì)一遍,避免一人同時(shí)采兩個(gè)或多個(gè)血標(biāo)本時(shí)拿錯(cuò)標(biāo)簽。在留樣時(shí),應(yīng)將血袋上的標(biāo)簽和試管上的標(biāo)簽再核對(duì)一遍?，F(xiàn)已有軟件要求將標(biāo)本和血袋捆綁在一起,在電腦上進(jìn)行血液和標(biāo)本雙掃碼,同時(shí)接收,若有不一致馬上出現(xiàn)提示,如發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤,要將其另行放置,并查找原因,及時(shí)進(jìn)行糾正。標(biāo)本留取需要加抗凝劑,有文獻(xiàn)報(bào)道,CPD血液保存液的成分可能對(duì)ELISA試驗(yàn)的反應(yīng)環(huán)境有影響,產(chǎn)生抑制作用,造成弱陽(yáng)性標(biāo)本判為假陰性,而漏檢。要保障標(biāo)本的質(zhì)量,還要建立嚴(yán)格的標(biāo)本采集、傳遞、儲(chǔ)存、運(yùn)輸制度。標(biāo)本離心要徹底,防止其中懸浮血凝塊、血細(xì)胞、纖維蛋白,影響加樣和檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于一些不能立即檢測(cè)的標(biāo)本,要及時(shí)分離出血清或血漿,放在-20℃以下冰箱保存,以備用。1.2b液的密封與保存試劑要在專門的試劑冰箱儲(chǔ)存,并每天按時(shí)進(jìn)行溫度登記。試劑使用時(shí),要看試劑瓶蓋是否完好,有無(wú)溢漏。試劑的量是否夠,板條是否密封。底物B液一般都在黑色試劑瓶閉光保存,以防失效。酶和板條若一次用不完,最好在用完后先放冰箱保存,試劑用完后,要將瓶蓋擰好。未開封且在保存溫度范圍內(nèi)試劑的有效期一般都是1年,對(duì)于開封后的試劑,再用時(shí)檢測(cè)結(jié)果往往偏低,對(duì)于一些弱陽(yáng)性標(biāo)本可能造成假陰性。因此,建議試劑打開后要盡快用完。1.3強(qiáng)化儀器設(shè)備的操作規(guī)程隨著自動(dòng)化辦公的普及,ELISA基本淘汰了純手工操作,儀器的使用在血液檢測(cè)中是必不可少的。目前主要使用的儀器有全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀、全自動(dòng)加樣儀、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣槍等。因此必須建立所有儀器設(shè)備的操作規(guī)程,制訂實(shí)施儀器設(shè)備的定期維護(hù)保養(yǎng)計(jì)劃,定期檢定、校準(zhǔn),貴重儀器應(yīng)有單獨(dú)的防護(hù)罩等,確保儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。在操作過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,并觀察儀器運(yùn)行狀況,以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題隨時(shí)解決。如在加樣時(shí),標(biāo)本離心不好,可能造成標(biāo)本加樣不夠或漏加,這時(shí)應(yīng)及時(shí)記錄下來(lái),按時(shí)補(bǔ)上。此外,還需要做好儀器使用記錄、故障檢修記錄、維護(hù)保養(yǎng)記錄、校準(zhǔn)和校準(zhǔn)驗(yàn)證記錄等,從各個(gè)方面確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2檢測(cè)到的質(zhì)量控制2.1a板孔的底部ELISA試驗(yàn)一般分四步:加樣即加標(biāo)本、酶結(jié)合物、底物及終止液。用微量加樣器加樣時(shí)應(yīng)將所加樣物加在ELISA板孔的中底部,注意不要濺出,不要產(chǎn)生氣泡。采用全自動(dòng)儀器進(jìn)行加樣時(shí),可能會(huì)遇到高濃度的抗原或抗體,出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象,造成假陽(yáng)性,需要再重新剪血袋的小辮手工檢測(cè)。加陰陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控品時(shí)不要污染別的板孔,手工加一些無(wú)色試劑時(shí)如底物,一定要看清楚,最好每加完一種試劑,都要看一下孔內(nèi)液面的高度,避免漏加、少加。2.2溫度大小對(duì)主導(dǎo)地位的影響抗原和抗體完全反應(yīng)必須在一定的溫度下反應(yīng)一段時(shí)間。溫育通常一般都在水浴箱中,溫度多控制在37℃左右,溫度低反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),相反溫度高反應(yīng)時(shí)間短,因此必須嚴(yán)格控制好溫度。溫育時(shí)間必須按說(shuō)明書操作,溫育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短,都可能造成假陰性,尤其不能因某些原因而縮短溫育時(shí)間,否則易造成假陰性,后果非常嚴(yán)重。2.3洗板機(jī)的影響有時(shí)因板條制作不好,板條與板條之間的距離不相等,可能使洗板機(jī)的針打到板條的邊上,或針孔堵塞,因此,在第一次洗板時(shí)一定要仔細(xì)觀察洗板機(jī),及時(shí)進(jìn)行調(diào)整以免造成花板,而進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。手工洗板時(shí)也要嚴(yán)格控制洗板次數(shù),增加洗板次數(shù)會(huì)造成部分與固相結(jié)合的抗原抗體脫離,從而影響檢測(cè)的靈敏度,使樣本檢測(cè)的吸光度(OD)值偏低。洗液要勤更換,避免滋生細(xì)菌。2.4試劑瓶和試劑瓶顯色劑有A和B兩種,B液一般怕光,要用棕色或黑色試劑瓶盛放,并且不能長(zhǎng)期在空氣中暴露。酶標(biāo)儀通過(guò)測(cè)OD來(lái)求值,有時(shí)可能因?yàn)榘宓子兴斐蓽y(cè)量值偏高或假陽(yáng)性,用雙波長(zhǎng)測(cè)量可消除一些干擾因素,結(jié)果更準(zhǔn)確。2.5灰區(qū)的設(shè)置和用量陰性和陽(yáng)性用Cut-Off(CO)值來(lái)判定。CO值上下的“灰區(qū)”應(yīng)引起重視。發(fā)生灰區(qū)反應(yīng)提示有一定的抗原抗體活性存在,因?yàn)樵诟腥驹缙?由于抗體或抗原含量較低,僅出現(xiàn)OD值輕微升高是可能的。所有感染的個(gè)體實(shí)際上在某一階段均經(jīng)過(guò)了灰區(qū)。為防止漏檢,提高輸血的安全性,灰區(qū)的設(shè)置有著重要的意義。對(duì)灰區(qū)反應(yīng)的標(biāo)本有條件的單位應(yīng)用更靈敏、更特異的方法來(lái)復(fù)查,無(wú)條件者應(yīng)對(duì)血液做報(bào)廢處理,以增加血液的安全系數(shù)。3結(jié)果與報(bào)告單的關(guān)系檢測(cè)完成后需要對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行核對(duì),首先是酶標(biāo)板肉眼觀測(cè)的結(jié)果是否與報(bào)告單一致,有時(shí)因酶標(biāo)板底部不干凈,使測(cè)試結(jié)果OD值高于CO值,而造成假陽(yáng)性。其次核對(duì)結(jié)果的輸入是否正確,陽(yáng)性標(biāo)本做不合格報(bào)廢處理,陰性標(biāo)本合格入庫(kù)。4工作人員4.1檢驗(yàn)程序優(yōu)化管理者雖不直接參與ELISA,但對(duì)檢測(cè)起著決定性的作用。因?yàn)樗麄冃枰獮閷?shí)驗(yàn)室建立內(nèi)部質(zhì)量管理體系,如統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、檢驗(yàn)程序文件、各種檢驗(yàn)記錄等。他們還是下屬人員錄用的決定者,也是對(duì)制度優(yōu)化和完善者。因此管理者必須是一名有能力建立一套能覆蓋所有檢驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果的質(zhì)量控制方案的領(lǐng)導(dǎo)者,有能力對(duì)下屬人員、儀器設(shè)備、試驗(yàn)過(guò)程、試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量管理和控制,不但要以身作則,而且要嚴(yán)格監(jiān)督下屬人員準(zhǔn)確完整地執(zhí)行操作規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4.2感官性能的測(cè)定品質(zhì):良好的職業(yè)道德和高質(zhì)量意識(shí)。體質(zhì):健康的體魄和優(yōu)良的感官性能。知識(shí):有足夠的專業(yè)知識(shí)、實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)、外語(yǔ)知識(shí)和質(zhì)量控制知識(shí)。技能:有熟練的實(shí)驗(yàn)操作技能、儀器操作技能、試劑配置技能和較強(qiáng)的分析判斷能力。4.3加強(qiáng)檢測(cè)過(guò)程控制首先,要每天按時(shí)消毒,搞好實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生,對(duì)各種儀器進(jìn)行檢查、維護(hù)和登記。其次,工作時(shí)一定要按規(guī)程操作,尤其是質(zhì)控品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照不要漏加。試驗(yàn)時(shí)每個(gè)板都要做好項(xiàng)目標(biāo)記,板條也要用數(shù)字標(biāo)記好,放到酶標(biāo)板的相應(yīng)位置上,板條放不好,可能將試劑加到孔外或卡住槍頭,還可能影響洗板或酶標(biāo)儀的測(cè)量。每一個(gè)過(guò)程和接口及儀器設(shè)備都必須按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作。再次,做好室內(nèi)質(zhì)控,當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測(cè)定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí),應(yīng)充分發(fā)揮所掌握的知識(shí)來(lái)分析判斷,只有這樣,才能找到失控的真正原因,避免同類現(xiàn)象重復(fù)出現(xiàn)。最后,認(rèn)真核對(duì)試驗(yàn)結(jié)果,尤其是陽(yáng)性或可疑標(biāo)本一定要核對(duì)準(zhǔn)確。原始記錄要完整、及時(shí)、真實(shí)、規(guī)范并長(zhǎng)期保存。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的精密度,精密度高不一定準(zhǔn)確度高,因此實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)參加各地區(qū)、省或國(guó)家舉辦的室間質(zhì)量評(píng)價(jià),來(lái)校正試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,從而