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第十一章

紫外－可見分光光度法紫外-可見分光光度法（ultravioletandvisiblespectrophotometry；UV-vis）：研究物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)（200-800nm）分子吸收光譜的分析方法。電子光譜應(yīng)用：定性、定量第一節(jié)紫外-可見分光光度法

的基本原理和概念一、電子躍遷紫外-可見吸收光譜產(chǎn)生原理：分子中的價電子在不同的分子軌道之間躍遷而產(chǎn)生。價電子：σ電子→單鍵π電子→雙鍵n(p)電子→非成鍵軌道：電子圍繞原子或分子運動的幾率。軌道不同，電子所具有能量不同。兩個原子的原子軌道以線性組合而生成兩個分子軌道。其中一個分子軌道具有較低能量稱為成鍵軌道，另一個分子軌道具有較高能量稱為反鍵軌道。電子能級：σ<π<n<π*<σ*分子中不同軌道的價電子具有不同能量，處于低能級的價電子吸收一定能量后，就會躍遷到較高能級。

H2的成鍵和反鍵軌道分子中價電子能級及躍遷圖σ<π<n<π*<σ*紫外-可見光區(qū)范圍內(nèi)，有機化合物的吸收光譜主要有：σ→σ*，π→π*，n→σ*，n→π*。無機化合物的吸收光譜主要有：電荷遷移躍遷和配位場躍遷。1、σ→σ*躍遷：ΔE很高，吸收峰在遠紫外區(qū)，<150nm，飽和烴。2、π→π*躍遷：ΔE較小，孤立雙鍵～200nm，體系共軛，ΔE更小，λ更長，ε>104，強吸收。3、n→π*躍遷：ΔE很小，近紫外區(qū)（200-400nm），含有雜原子不飽和基團，ε10-100，吸收弱

。4、n→σ*躍遷：ΔE較小，紫外區(qū)（～200，150-250nm），含有雜原子飽和基團。按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*躍遷類型ΔE吸收峰位置典型結(jié)構(gòu)σ→σ*很大遠紫外區(qū)，<150nm飽和烴

n→σ*較大近紫外區(qū)（200-400nm）含有雜原子飽和基團：如-OH、-NH2、-X、-S

π→π*較小孤立雙鍵～200nm體系共軛，λ更長CH2=CH2-CH=CH-CH=CH-

n→π*很小紫外區(qū)（～200，150-250nm）含有雜原子不飽和基團：如-C=O、-C=S、-N=N-、-C≡N

n

max（nm）

max118010,000221721,000326834,000430464,0005334121,0006364138,0005、電荷遷移躍遷：用電磁輻射照射化合物時，電子從給予體向接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷，實質(zhì)為內(nèi)氧化還原過程。

特點：ε>104，強吸收。

結(jié)構(gòu)：有機化合物：如取代芳烴。無機化合物：過渡金屬離子與含生色團試劑反應(yīng)所生成的配合物以及許多水合無機離子。6、配位場躍遷：配體存在下過渡元素5個能量相等的d軌道及鑭、錒元素7個能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道及f軌道，當它們吸收光能后，低能態(tài)的d電子或f電子可以分別躍遷到高能態(tài)的d或f軌道上去。

特點：ε<102，可見光區(qū)。二、紫外-可見吸收光譜的常用概念吸收光譜（absorptionspectrum）：吸收曲線，以波長λ(nm)為橫坐標，以吸光度A（或透光率T）為縱坐標所描繪的曲線。吸收峰：曲線上吸光度最大的地方，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長（λmax）。谷：峰與峰之間吸光度最小的部位，該處的波長稱最小吸收波長（λmin）。肩峰（shoulderpeak）：在一個吸收峰旁邊產(chǎn)生的一個曲折。末端吸收（endabsorption）：只在圖譜短波端呈現(xiàn)強吸收而不成峰形的部分。吸收光譜示意圖1.吸收峰2.谷3.肩峰4.末端吸收生色團（chromophore）：有機化合物分子結(jié)構(gòu)中含有π→π*躍遷或n→π*躍遷的基團，即能紫外-可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團，如C=C、C=O、-N=N-、-NO2、-C=S等。助色團（auxochrome）：含有非鍵電子的雜原子飽和基團，當它們與生色團或飽和烴相連時，能使該生色團或飽和烴的吸收峰向長波方向移動，并使吸收強度增加的基團，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-X等。紅移（redshift）：長移(bathochromicshift)，由于化合物的結(jié)構(gòu)改變，如發(fā)生共軛、引入助色團，以及溶劑改變等，使吸收峰向長波方向移動的現(xiàn)象。藍（紫）移（blueshift）：短移(hypsochromicshift)，化合物結(jié)構(gòu)改變時或受溶劑影響使吸收峰向短波方向移動的現(xiàn)象。增色效應(yīng)和減色效應(yīng)：由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強度增加稱增色效應(yīng)或濃色效應(yīng)（hyperchromiceffect），使吸收減弱稱減色效應(yīng)或淡色效應(yīng)（hypochromiceffect）。強帶和弱帶（strongbandandweakband）：化合物的紫外-可見吸收光譜中，凡摩爾吸光系數(shù)εmax大于104，的吸收峰稱強帶，凡εmax小于102的吸收峰稱弱帶。三、吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系吸收帶（absorptionband）：吸收峰在紫外-可見光譜中的位置。六種類型：1、R帶：由n→π*躍遷引起，雜原子不飽和基團發(fā)色團特征，-C=O、-NO、-NO2、-N=N-等。特點：波長較長（-300nm），弱吸收，ε<100。溶劑極性↑→R帶短移；強吸收在附近時→R帶長移，有時被掩蓋。2、K帶：由π→π*躍遷引起，共軛雙鍵特點：強吸收，εmax>104。3、B帶：芳香族（包括雜芳香族）化合物特征吸收帶，由π→π*躍遷引起。特點：苯蒸氣在230-270nm處出現(xiàn)精細結(jié)構(gòu)的吸收光譜，稱苯的多重吸收帶；苯在溶液中，譜帶較寬；極性溶劑中，B帶為一寬峰，重心在256nm附近，ε～200。4、E帶：芳香族化合物特征吸收帶，由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個乙烯的環(huán)狀共軛系統(tǒng)的π→π*躍遷引起，分為E1和E2帶。特點：E1～180nm，ε～4.7×104；E2～200nm，ε～7000，均為強吸收。

苯的B帶吸收光譜苯異丙烷溶液紫外吸收光譜A為稀薄蒸氣（壓力很小）的吸收光譜圖，每條黑線表示一種轉(zhuǎn)動躍遷的吸收線；每組黑線表示一種振動躍遷的吸收帶；a-f表示電子躍遷的吸收帶。

B為蒸氣壓力較大時的吸收光譜圖，其中轉(zhuǎn)動躍遷的吸收線已分辨不清。C為溶液的吸收光譜圖，僅呈現(xiàn)電子躍遷的吸收帶，振動與轉(zhuǎn)動躍遷的吸收已分辨不清。5、電荷轉(zhuǎn)移吸收帶：許多無機物（如堿金屬鹵化物）和某些有機物混合而得的分子配合物引起。特點：近紫外和可見光區(qū)。吸收強度大，

max>104，測定靈敏度高。6、配位體場吸收帶：過渡金屬水合離子與顯色劑（通常為有機化合物）所形成的配合物引起。特點：可見光區(qū)。

四、影響吸收帶的因素核心：對分子中電子共軛結(jié)構(gòu)的影響。1、位阻影響：兩個發(fā)色團共軛→吸收帶長移。若兩發(fā)色團由于立體阻礙其處于同一平面，會影響共軛效應(yīng)。如二苯乙烯。RR′

max（nm）

maxHH29427,600HCH327221,000CH3CH3243.512,300CH3C2H524012,000C2H5C2H5237.511,0002、跨環(huán)效應(yīng)：β、γ不飽和酮中，由于立體排列，使羰基孤對電子和雙鍵的π電子作用，使相當于n→π*躍遷的R帶長移，同時吸收強度增強。當C=O的π軌道與一個雜原子的P軌道能夠有效交蓋時，也會出現(xiàn)跨環(huán)效應(yīng)。

3、溶劑效應(yīng)：溶劑極性。極性溶劑：π→π*躍遷→長移，n→π*躍遷→短移，后者移動一般比前者大。*原因：π→π*躍遷吸收長移，激發(fā)態(tài)的極性總比基態(tài)極性大，因而激發(fā)態(tài)與極性溶劑之間相互作用所降低的能量大。

n→π*躍遷吸收短移，是由于基態(tài)極性大，非鍵電子與極性溶劑之間能形成較強的氫鍵，使基態(tài)能量降低大于反鍵軌道與極性溶劑相互作用所降低的能量，因而躍遷所需能量變大。

溶劑的選擇：極性；純度高；截止波長<λmax4、體系pH的影響：pH→分子離解。

***極性溶劑對兩種躍遷能級差的影響**五、朗伯-比爾定律朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律：描述物質(zhì)對單色光吸收的強弱與吸光物質(zhì)的濃度和厚度間關(guān)系的定律。

假設(shè)一束平行單色光通過一個吸光物體取物體中一極薄層dxE為吸光系數(shù)，物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度。給定單色光、溶劑和溫度等條件下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特性常數(shù)，表明物質(zhì)對某一特定波長光的吸收能力。吸光系數(shù)大，則物質(zhì)吸光能力強。表示方式：1、摩爾吸光系數(shù)：一定波長時，溶液濃度1mol/L，厚度為1cm的吸光度，用ε或EM表示。2、百分吸光系數(shù)（比吸光系數(shù)）：在一定波長時，溶液濃度為1%（W/V），厚度為1cm的吸光度，用E1cm1%表示。兩者關(guān)系：ε=(M/10)·E1cm1%吸光系數(shù)→吸收強弱：

ε104～105→強吸收

102～104→中強吸收

﹤102→弱吸收1-10：很弱10-102：弱102-103：中等103-104：強104-105：很強六、偏離比爾定律的因素（一）化學因素前提是稀溶液，因濃度改變而有離解、締合、與溶劑間的作用等原因而發(fā)生。例：亞甲藍、重鉻酸鉀

（二）光學因素1、非單色光：前提是入射光為單色光。譜帶寬度（bandwidth）：當光源為連續(xù)光譜時，采用單色器分離出來的光同時包含了所需波長的光和附近波長的光，即是具有一定波長范圍的光，這一寬稱為譜帶寬度，用半峰寬S表示。

單色光的譜帶寬S=λ1-λ2入射光的譜帶寬度嚴重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀注意：選擇較純單色光（Δλ↓，單色性↑）選λmax作為測定波長（ΔE↓，S↑且成線性）2、雜散光（straylight）：一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長相隔較遠的光。雜散光來源：儀器本身缺陷；光學元件污染造成。雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值。ChP（2005）對雜散光的檢查：方法：可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。試劑濃度/%（g/ml）測定用波長/nm透光率/%碘化鈉1.00220<0.8亞硝酸鈉5.00340<0.83、散射光和反射光：吸光質(zhì)點對入射光有散射作用。入射光在吸收池內(nèi)外界面之間通過時有反射作用。反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光，直接對T產(chǎn)生影響。散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形。消除：一般可用空白對比校正消除4、非平行光：使光程↑，A↑，吸收光譜變形。（三）透光率測量誤差透光率測量誤差ΔT是測量中的隨機誤差，來自儀器的噪音（noise）。一類與光訊號無關(guān)，稱暗噪音（darknoise）。一類隨光訊號強弱而變化，稱散粒噪音（signalshotnoise）。1、暗噪音——與檢測器和放大電路不確切性有關(guān)與光訊號無關(guān)其強弱取決于各種電子元件和線路結(jié)構(gòu)的質(zhì)量、工作狀態(tài)以及環(huán)境條件等。

2、訊號噪音：每一單位時間中電子遷移數(shù)量是不相等的，而是在某一均值周圍的隨機數(shù)，形成測量光強時的不確定性。

表明測量誤差較小的范圍一直可延至較高吸光度區(qū)，對測定有利。第二節(jié)紫外-可見分光光度計一、主要部件1、光源要求：強度足夠且穩(wěn)定、連續(xù)光譜且發(fā)光面積小。（1）鎢燈或鹵鎢燈：>350nm可見區(qū)光源。

鹵鎢燈燈泡內(nèi)含碘和溴的低壓蒸氣，鎢絲壽命↑，發(fā)光強度高。（2）氫燈或氘燈：150-400nm的連續(xù)光譜，用于紫外光區(qū)。

氘燈發(fā)光強度和使用壽命較好。2、單色器：狹縫、準直鏡、色散元件色散元件：棱鏡、光柵光柵：鋁作反射面，在平滑玻璃表面上，每毫米刻槽600-1200條。準直鏡：鍍鋁的拋物柱面反射鏡。狹縫：寬度適當，以嘗試減少狹縫寬度，試樣吸光度不再改變時的寬度為宜。3、吸收池玻璃：可見光區(qū)石英：紫外、可見光區(qū)4、檢測器光電效應(yīng)檢測器，將接收到的輻射功率變成電流的轉(zhuǎn)換器。（1）光電池硒光電池：可見光區(qū)硅光電池：紫外、可見光區(qū)原理：為一種光敏半導體，當光照時產(chǎn)生光電流，一定范圍內(nèi)光電流大小與照射光強成正比，直接用微電流計測量。（2）光電管原理：由一個陽極和一個光敏陰極組成的真空（或充少量惰性氣體）二極管，陰極表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光敏材料，當它被有足夠能量的光照射時，能夠發(fā)射出電子。當在兩極間有電位差時，發(fā)射出的電子流向陽極而產(chǎn)生電流，電流大小取決于照射光的強度。例：紫敏光電管、紅敏光電管（3）光電倍增管原理：光敏金屬的陰極和陽極之間有幾個倍增級（一般是九個）。（4）光二極管陣列檢測器原理：在晶體硅上緊密排列一系列光二極管，每一個二極管相當于一個單色儀的出口狹縫。在極短時間，可獲得全光光譜。

5、訊號處理與顯示器由電表指示、數(shù)字顯示、熒光屏顯示、結(jié)果打印、曲線掃描等。顯示方式：透光率和吸光度。二、分光光度計的類型和光學性能

（一）光路類型單光束雙光束二極管陣列特點：從光源到單色器只有一束單色光使用時來回拉動吸收池對光源發(fā)光強度穩(wěn)定性要求較高

1溴鎢燈2氘燈3凹面鏡4入射狹縫5平面鏡6、8準直鏡7光柵9出射狹縫10調(diào)制器11聚光鏡12濾色片13樣品室14光電倍增管單光束分光光度計雙光束分光光度計1鎢燈2氘燈3凹面鏡4濾光片5入射狹縫6、10、20平面鏡7、9準直鏡8光柵11出射狹縫12、13、14、18、19凹面鏡15、21扇面鏡16參比池17樣品池22光電倍增管特點：光束幾乎同時通過樣品池和參比池，可消除光源不穩(wěn)定產(chǎn)生的誤差。分為兩種：時間分隔、空間分隔

單光束雙光束（空間分隔）雙光束（時間分隔）光多道二極管陣列檢測的分光光度計1光源：鎢燈或氘燈2、5消色差聚光鏡3光閘4吸收池6入口狹縫7全息光柵8二極管陣列檢測器特點：復色光透過樣品池后再經(jīng)分光系統(tǒng)分光在1/10s的極短時間內(nèi)獲得從190-820nm范圍的全光光譜（二）光學性能1、波長范圍：195-820nm2、波長準確度：誤差≤±0.5nm3、波長重現(xiàn)（復）性：重復使用同一波長光，變動值≤±0.5nm4、透光率測量范圍：0-150%（T）5、吸光度測量范圍：-0.173～+2.00（A）6、光度準確度：以透光率測量值誤差表示。透光率滿量程誤差為≤±0.5%7、光度重復性：同樣情況下重復測量透光率的變動性：≤±0.5%8、分辨率：單色器分辨兩條靠近的譜線的能力。9、雜散光：以測光訊號較弱的波長處（200或220nm，310或340nm處）所含雜散光的強度百分比為指標。（三）儀器的校正1、波長的校正氫燈或氘燈：常用486.13nm（F線）和656.28nm（C線）。稀土玻璃（鐠釹玻璃、鈥玻璃）：在較寬的波長范圍內(nèi)有特征吸收。某些元素輻射產(chǎn)生強譜線：汞燈546.1nm，鉀776.5nm，銣780.0nm，銫852.1nm等。苯蒸氣：在紫外區(qū)有特征吸收峰。2、吸光度的校正

某些物質(zhì)如硫酸銅、硫酸鈷銨、鉻酸鉀的標準溶液。ChP（2005）采用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定方法：取在120℃干燥至恒重的基準重鉻酸鉀60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。

波長/nm235（最小）257（最大）313（最?。?50（最大）吸收系數(shù)(E1cm1%)的規(guī)定值124.5144.048.6106.6吸收系數(shù)(E1cm1%)的許可范圍123.0-126.0142.8-146.247.0-50.3105.5-108.53、吸收池的校正（配對）吸收池A：試樣溶液，吸收池B：參比溶液→A1吸收池A：參比溶液，吸收池B：試樣溶液→A2要求前后兩次測得的吸光度差值應(yīng)小于1%。第三節(jié)紫外-可見分光光度

分析方法定性鑒別純度檢查定量測定單組分定量多組分定量—計算分光光度法一、定性鑒別有機分子的紫外吸收的波長和強度，主要取決于分子中的生色團和助色團及其共軛情況。定性依據(jù)：

吸收光譜—形狀、吸收峰數(shù)目、各吸收峰的波長位置、強度和相應(yīng)的吸光系數(shù)值等。方法：對比法—將試樣的吸收光譜特征與標準化合物的吸收光譜特征進行對照比較，或利用文獻所載的紫外-可見吸收圖譜進行核對。

1、對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：λmax、ε或E1cm1%鹽酸布比卡因（原料藥）鑒別方法（ChP2005）取本品，精密稱定，按干燥品計算，加0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋成每1ml中含0.40mg的溶液，照紫外-可見分光光度法測定，在263nm與271nm的波長處有最大吸收；其吸收度分別為0.53～0.58與0.43～0.48。維生素B1吸收系數(shù)的測定方法（ChP2005）取本品，精密稱定，加鹽酸溶液（9→1000）溶解并定量稀釋制成每1ml約含12.5μg的溶液，照紫外-可見分光光度法，在246nm的波長處測定吸光度，吸收系數(shù)（E1cm1%）為406～436。

2、對比吸光度（或吸光系數(shù)）的比值：不同吸收峰（或峰與谷）處測得吸光度的比值。維生素B12（原料藥）鑒別方法（ChP2005）取含量測定項下的溶液（取維生素B12加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含25μg的溶液），照紫外-可見分光光度法測定，在278nm、361nm與550nm的波長處有最大吸收。361nm波長處的吸光度與278nm波長處的吸光度的比值應(yīng)為1.70～1.88。361nm波長處的吸光度與550nm波長處的吸光度的比值應(yīng)為3.15～3.45。3、對比吸收光譜的一致性：有標準品的情況下，配制相同濃度溶液，在相同條件下測定兩溶液吸收光譜，是否一致；或與文獻標準圖譜比較一致性。二、純度檢查1、雜質(zhì)檢查化合物在紫外-可見區(qū)沒有吸收，而雜質(zhì)有較強的吸收：乙醇或環(huán)己烷中含有少量雜質(zhì)苯?；衔镉休^強的吸收峰，而雜質(zhì)在此波長處無吸收峰或吸收很弱，雜質(zhì)的存在將使化合物的吸光系數(shù)值降低；雜質(zhì)在此吸收峰處有比化合物更強的吸收，將使吸光系數(shù)值增大。雜質(zhì)→化合物的吸收光譜變形。2、雜質(zhì)的限量檢測不影響藥物的療效和不發(fā)生毒性的前提下，允許藥物中存在有一定量的雜質(zhì)，這一允許量稱為雜質(zhì)的限量。化合物某波長處無吸收，雜質(zhì)有吸收，規(guī)定測定條件下吸光度值。腎上腺素中酮體的檢查（ChP2005）取本品，加鹽酸溶液（9→2000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，照紫外-可見分光光度法，在310nm的波長處測定，吸光度不得過0.05。規(guī)定峰谷吸收度的比值。碘解磷定注射液檢查項下（ChP2005）分解產(chǎn)物避光操作。取含量測定項下的溶液（取藥品，加鹽酸（9→1000）稀釋制成約12μg/ml溶液），在1小時內(nèi)，照紫外-可見分光光度法，在294nm與262nm的波長處分別測定吸光度，其比值應(yīng)不小于3.1。

三、單組分的定量方法

吸光系數(shù)法、校正曲線法、對照法（一）吸光系數(shù)法（絕對法）原理：A=ECl，已知吸光系數(shù)時，根據(jù)測得的A直接求出被測物的濃度。C=A/(El)例：維生素B12水溶液在361nm處的E1cm1%值是207，1cm吸收池，測得A為0.414，溶液的濃度？C=A/(El)=0.414/(207×1)=0.0200(g/100ml)=0.2mg/ml例：精密稱取B12樣品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm（E1cm1%207）處測定吸光度為0.507，求B12的百分含量？（二）校正曲線法原理：A∝C，配制一系列已知濃度的標準溶液，在相同條件下測定其吸光度A值，以標準溶液濃度為橫坐標，以A為縱坐標，繪制A-C曲線，可獲得一條理論上通過原點的直線。在相同條件下測定試樣溶液的A值，從曲線上查出試樣的濃度?；蜃髦本€回歸，得出直線方程，求出試樣濃度。優(yōu)點：即使儀器單色光不純也可得出試樣準確濃度，也可消除因環(huán)境引起的儀器誤差。（三）對照法原理：在相同條件下配制已知濃度的標準溶液和試樣溶液，分別測定吸光度，依朗伯-比爾定律：As/Ax=Cs/Cx例：精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對照液，精密稱定對照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測定吸光度為0.508和0.518，求B12注射液注射液的濃度以及標示量的百分含量（該B12注射液的標示量為100μg/mL）紫外-可見分光光度法可用于弱酸（堿）離解常數(shù)和配合平衡常數(shù)及配合物組成的測定。一元弱酸的離解常數(shù)的測定：原理：配制分析濃度為C的弱酸溶液，分別調(diào)節(jié)pH為酸性、堿性及二者之間，一定波長下測定二份溶液吸光度值。酸性溶液：AHA=εHAC堿性溶液：AA-=εA-C二者之間溶液：A=AHA+AA-=εHA[HA]+εA-[A-]四、同時測定多組分的定量方法----計算分光光度法多組分測定分為三各情況：（1）各組分的吸收峰所在波長處，其他組分沒有吸收，按單組分方法。（2）吸收光譜有部分重疊，先在一波長處求出無干擾組分的濃度，再依據(jù)吸光度加和性，在另一波長處求出另一組分含量。（3）吸收光譜相互都有干擾，依據(jù)吸光度的加和性，兩波長處已知的各吸光系數(shù)，測得的吸光度值，解方程組，求出兩組分濃度。計算分光光度法：運用數(shù)學、統(tǒng)計學與計算機科學的方法，在傳統(tǒng)分光光度法基礎(chǔ)上，通過測量試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)的變換、解析和預測對物質(zhì)進行定性定量的方法。可分為數(shù)值計算法和數(shù)學變換法兩大類。數(shù)值計算法：對于含n個組分的混合物，在m個波長處測得吸光度值，則可得含m個n元一次方程的線性方程組。常用的方法有圖解法、信號處理方法和矩陣解法。數(shù)學變換法：通過數(shù)學處理對以Beer定律為基礎(chǔ)的吸光度分析作一次數(shù)學的抽象，建立吸收曲線的數(shù)學信息與物質(zhì)的量之間的聯(lián)系，并據(jù)此對物質(zhì)進行定性、定量的方法。主要有導數(shù)光譜法、正交函數(shù)法和褶合光譜法。

（一）雙波長法1、等吸收雙波長消去法原理：a，b兩組分混合物中，消除b的干擾以測定a時，從b的吸收光譜上選擇兩個吸光度相等的波長λ1和λ2，測定混合物的吸光度差值，根據(jù)ΔA計算a的含量。波長選擇原則：①干擾組分b在這兩個波長應(yīng)具有相同的吸光度，A2b=A1b。②待測組分a在這兩個波長處的吸光度差值ΔAa應(yīng)足夠大。方法：消除b的干擾以測定a方法：消除a的干擾以測定b2、系數(shù)倍率法原理：設(shè)某一干擾組分在選定兩個波長λ1和λ2處測得吸光度比值為K，即A1/A2=K，則ΔA=KA2-A1=0。方法：設(shè)y為干擾組分，x為待測組分兩個波長處，Ay1/Ay2=K，即Ay1=KAy2，設(shè)A2=K(Ax2+Ay2)ΔA=A2-A1=K(Ax2+Ay2)-(Ax1+Ay2)=KAx2-Ax1=(KEx2-Ex1)C·lK稱為掩蔽系數(shù)，K值一般為5-7。

xy五、紫外吸收光譜法用于有機化合物分子結(jié)構(gòu)研究（一）有機化合物的紫外吸收光譜有機化合物的紫外吸收光譜特征，主要決定于分子中生色團和助色團以及它們的共軛情況。確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)時，紫外光譜必須與紅外、質(zhì)譜和核磁共振等聯(lián)合。1、飽和碳氫化合物特點：σ電子，σ→σ*，ΔE很大，吸收峰<200nm，常用作溶劑。

2、含孤立助色團和生色團的飽和有機化合物孤立助色團：含雜原子的飽和基團。

特點：σ電子、n電子σ→σ*，n→σ*→吸收峰在～200nm，吸收較弱。孤立生色團：含雜原子不飽和基團，或含孤立雙鍵。

特點：1）孤立雙鍵：π電子，π→π*，吸收峰150-180nm之間。2）雜原子不飽和基團：含羰基結(jié)構(gòu)，醛和酮，σ，n，π電子，三個吸收峰：n→σ*，吸收峰190nm左右；π→π*，吸收峰150-180nm之間；n→π*，吸收峰275-295nm之間。

3、共軛烯烴

特點：形成大π鍵，雙鍵↑→ΔE↓→λmax↑。

4、α，β不飽和酮、醛、酸、酯

特點：1）C=C與C=O共軛，π→π*，吸收峰200-260nm之間，ε約10000，為強吸收。2）n→π*，吸收峰310-350nm之間，ε<100。3）溶劑極性影響吸收峰位置，極性↑→π→π*紅移，n→π*藍移。

5、芳香族化合物（1）苯和取代苯苯：π→π*躍遷產(chǎn)生E1、E2、B帶三個吸收帶，尤B帶精細結(jié)構(gòu)。取代苯：取代基使三個吸收帶均長移，ε值增大，B帶精細結(jié)構(gòu)簡單化。

取代基不同，紅移效應(yīng)不同，強弱不同：供電子取代基：-CH3<-Cl<-Br<-OH<-OCH3<-NH2<-O<-NHCOCH3<-NCH3。吸電子取代基：-NH3+<-SO2NH2<-COO-≤-CN-<-COOH<-CHO<-NO2。

烷基取代：吸收帶略長移，吸收強度略增加。助色團取代：E2和B帶明顯長移，ε顯著增大。

√注：溶劑極性和溶液pH值影響。

生色團取代：200-250nm出現(xiàn)K帶，ε>104，B帶長移大。（2）芳雜環(huán)化合物飽和五元和六元雜環(huán)化合物吸收峰波長都<200nm。五元芳雜環(huán)：n電子參加芳環(huán)大π鍵的形成，故不顯現(xiàn)n→π*躍遷特征，其紫外吸收光譜與環(huán)戊二烯相似。六元氮芳雜環(huán)：紫外光譜與相應(yīng)的芳烴相似，B帶強度增大，精細結(jié)構(gòu)簡單化甚至消失，增加一n→π*躍遷，吸收帶常被掩蓋。稠環(huán)化合物：隨著稠環(huán)數(shù)增加，相應(yīng)的吸收帶向長波方向位移。（二）有機化合物結(jié)構(gòu)的研究1、從吸收光譜中初步推斷官能團220-800nm范圍內(nèi)無吸收（ε<1）→脂肪族飽和碳氫化合物。210-250nm有吸收→可能含有兩個共軛單位。260-300nm有強吸收→可能含有3-5個共軛單位。（260