糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶課件

第二節(jié)

糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用第二節(jié)

糖基轉(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用1主要內(nèi)容糖轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)介糖基轉(zhuǎn)移酶在合成中的應(yīng)用主要內(nèi)容糖轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)介2Glycosyltransferases應(yīng)用‘a(chǎn)ctivated’sugarphosphates作為糖供體，合成glycosidiclinkage，糖受體通常為nucleophilicgroup,usuallyanalcohol.生成的糖苷可以為O-,N-,S-,orC-glycoside糖轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)介功能：催化糖苷鍵的合成（O-,N-,S-,orC-glycoside

）供體：活化的糖磷酸受體：親核基團(tuán)（蛋白、脂、核酸、糖、小分子），通常為-OHGlycosyltransferases應(yīng)用‘a(chǎn)ctiva3Non-Leloirdonors：Leloirdonors：糖供體底物糖基轉(zhuǎn)移酶根據(jù)糖供體中是否含有核苷酸分為兩類。Leloir:阿根廷生物化學(xué)家，研究核苷酸代謝，1970，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Non-Leloirdonors：Leloirdonor4分為94家族（distinctsequence-basedfamilies）(CAZyserver,rs-mrs.fr/CAZY)人類擁有約270多種糖基轉(zhuǎn)移酶序列，屬于33個(gè)家族。Alpha-1,4-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；beta-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶；2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶分類根據(jù)氨基酸序列相似性進(jìn)行分類：根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行分類：根據(jù)糖供體和糖苷鍵連接方式進(jìn)行分類：GT-A，GT-B，其他類型分為94家族（distinctsequence-5Rossmann-typedomains(fornucleotidebinding)NDP-bindingdomaingenerallycontainsaconservedDXDaminoacidmotifRossmann-typedomains(fornuc6GT-Afold:SpsAfromBacillussubtilusGT-Bfold:beta-glucosyltransferasefrombacteriophageT4LeloirGTsTransglycosylasefromStaphylococcusaureusOligosaccharyltransferaseSTT3fromPyrococcusfuriosiusNon-LeloirGTsGT-Afold:SpsAfromBacillus7催化機(jī)理Glycosyltransferasescatalyzethetransferofglycosylgroupstoanucleophilicacceptorwitheitherretentionorinversionofconfigurationattheanomericcentre.Thisallowstheclassificationofglycosyltransferasesaseitherretainingorinverting

enzymes.催化機(jī)理Glycosyltransferasescatal8鎓

催化機(jī)理Inverting:SN2nucleophilicattackattheC1atomRetaining:doubledisplacementmechanism鎓催化機(jī)理Inverting:SN2nucleophi9糖基轉(zhuǎn)移酶輔因子Many,butnotall,glycosyltransferasesutilizedivalentmetalioncofactorssuchasMn2+andMg2+.

…mainlyinglycosyltransferasesthatare

diphosphonucleoside-dependent.metalioniscoordinatedtoanoxygenofeachofthetwophosphategroups,aswellastoside-chaincarboxylatesderivedfromtheprotein..糖基轉(zhuǎn)移酶輔因子Many,butnotall,gl10

糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑直接抑制糖基轉(zhuǎn)移酶活性底物類似物；過渡態(tài)類似物alpha-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑Beta-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑直接抑制糖基轉(zhuǎn)移酶活性底物類似物；過渡態(tài)11阻斷糖供體的合成N-Glycan合成過程中，首先要合成：dolichol-pp-N-acetylglucosamineUDP-GlcANc+dolichol-p------dolichol-pp-GlcNAcN-acetylglucosaminephosphorotransferase阻斷糖供體的合成N-Glycan合成過程中，首先要合成：d12糖基轉(zhuǎn)移酶在合成中的應(yīng)用寡糖的酶法合成具有生物活性含糖天然產(chǎn)物的酶法合成生物制藥----糖蛋白藥物生產(chǎn)策略生物制藥----糖疫苗生產(chǎn)策略糖基轉(zhuǎn)移酶在合成中的應(yīng)用寡糖的酶法合成13ChemicalSynthesisofa-Gal規(guī)模小，過程復(fù)雜，立體選擇性難ChemicalSynthesisofa-Gal規(guī)模小14ReactionCatalyzedbya1,3-GalactosyltransferaseReactionCatalyzedbya1,3-Gal15碳水化合物的合成碳水化合物的合成16體內(nèi)糖供體合成途徑Glc,GlcNAc&ManSugar-6-pSugar-1-pSugar-NDPkinaseMutasepyrophorylaseGal,GalNAc&FucSugar-1-pSugar-NDPkinasepyrophorylaseNeu5AcNeu5AcCMP-Neu5AcpyrophorylaseCTP體內(nèi)糖供體合成途徑Glc,GlcNAc&ManSug17糖供體相互轉(zhuǎn)化:GalE:UDP-Gal?UDP-GluGalNAcE:UDP-GalNAc?UDP-GlcNAcUGD(UDP-Glcdehydrogenase)：UDP-Glc?UDP-GlcAUDP-GlcAdecarboxylase:UDP-GlcA?UDP-Xyl糖供體相互轉(zhuǎn)化:18糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的寡糖合成PhosphorylasesGlucosyltransferasesFructosyltransferasesCyclodextringlucanotransferasesMany糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的寡糖合成PhosphorylasesGlu19微生物中的糖供體天然糖苷化合物中的糖一般為C2,C3,C4and/orC6脫氧糖，而且大部分為6-deoxyhexosesfamily（Rhamnose）原核生物糖轉(zhuǎn)移酶具有糖供體的廣泛性6-deoxyhexoses一般通過TDP-sugars進(jìn)行底物活化（TDP-Rhamnose）微生物中的糖供體天然糖苷化合物中的糖一般為C2,C3,20優(yōu)點(diǎn):區(qū)域、立體選擇性大量生產(chǎn)不足:

*糖基轉(zhuǎn)移酶在大量表達(dá)方面存在困難糖供體比較昂貴.副產(chǎn)物抑制消除副產(chǎn)物抑制（堿性磷酸酶）原位產(chǎn)生糖供體

合成廉價(jià)的糖供體類似物.針對(duì)以上不足解決策略糖基轉(zhuǎn)移酶在工業(yè)應(yīng)用中優(yōu)勢(shì)與弱點(diǎn)可作為L(zhǎng)gtC底物優(yōu)點(diǎn):不足:消除副產(chǎn)物抑制（堿性磷酸酶）針對(duì)以上不足解決21堿性磷酸酶堿性磷酸酶22酶法再生糖供體策略

UDP-sugar(A)andCMP-sugar(B)酶法再生糖供體策略23糖供體的合成糖供體的合成24糖供體的合成糖供體的合成25糖供體的合成糖供體的合成26糖基轉(zhuǎn)移酶在寡糖合成中的應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶在27（一）

具有生物活性寡糖的酶法合成（一）

具有生物活性寡糖的酶法合成28糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶課件29糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶課件30糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶課件31Biomedicaluseofa-Galsolublea-Galantagonisttoanti-Gala-Galconjugatesinimmunotherapyagainstbacteria,virus,andcancercells.人工合成的必要性Biomedicaluseofa-Galsolub32糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶課件33a1,3GalT催化合成a-GalEpitopes及其衍生物HOOOHHOHOOUDPHOOOHHOHOOUDPOHOOHHOOOOHHOR1R2HOOHOOHHOHOOHOOHOHOOOOHHOR1R2UDP-Gal4-epimeraseUDPa1,3GalTR1R2OHOHOHOHNHAcbN3bSPhbOAllylabcdNHAcOHeNH2OHfUDP-Gal100mg/$416UDP-Glc5g/$529.5ECFangJ,ChenX,WangPG,etal.:J.Org.Chem.1999,64,4089-4094.a1,3GalT催化合成a-GalEpitopes及34通過原位再生合成a-Gal五糖FangJ,LiJ,ChenX,WangPG,etal:J.Am.Chem.Soc.1998,120,6635-6638.通過原位再生合成a-Gal五糖FangJ,LiJ,35其他生物活性寡糖的合成（應(yīng)用）InHumanmilkOOHOHOOHOOHOHOOHOHHOOOHOOOHOHOHOOHa1,4GalTlgtC

gene(a)

globotriose

Gb3OHOHOAcHNOHOOHOHOOHOOHOHOOHOHOHOOHOOHb1,3GalNAcTlgtD

gene(b)

globotetrose

Gb4OHOOHOOHOOHOHOOHOHHOOHOAcHNOH(c)

LNT-2b1,3GlcNAcTlgtA

geneOHOOHOOHOOHOHOOHOHOOHOAcHNOH(d)

LNnT:

Lacto-N-neotetraoseb1,4GalTlgtB

geneHOOHOHOOHOHOOHOOHOOHOHOOHOHOHOAcHNOHa2,3transialidase(e)

LSTDOHOAcHNHOOHHOHO2COH其他生物活性寡糖的合成（應(yīng)用）InHumanmilkOO36(WithouttheBsubunits,theAsubunithasnowayofattachingtoorenteringthecell,andthusnowaytoexertitstoxiceffect.)StxisanAB5subunittoxin.Thepentamerof(small)Bsubunitsbindingtoitsreceptorglycosphingolipid(GSL),globotriaosylceramide(Gb3)inglomerularendothelialcellmembranes,initiatesAsubunit-mediatedcelldeathleadingtoHUS（hemolyticuremicsyndrome）,butinductionofinflammatorypathwaysisalsokey.Gb3isheterogenousinitslipidstructureandmembraneorganization,suchthatdifferentGb3formatsaredifferentiallyrecognizedbyStxfamilymembers,particularlyStx2,whichismorefrequentlyassociatedwithclinicaldisease.(WithouttheBsubunits,theA37血型相關(guān)抗原酶法合成血型相關(guān)抗原酶法合成38FluorescentlylabeledsLexconjsLex在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌高表達(dá)二價(jià)腫瘤抗原酶法合成（用于檢測(cè)腫瘤位置）FluorescentlylabeledsLexcon39糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用乳腺癌、前列腺癌上高表達(dá)Globo-HP-凝集素配體糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用乳腺癌、前列腺癌P-凝集素配體40防治黑色素瘤防治黑色素瘤41寡糖的合成常常需要多種糖基轉(zhuǎn)移酶為了增加產(chǎn)量還有用其他一些酶分步合成費(fèi)時(shí)費(fèi)力？一鍋多酶法------Superbeads-------Superbug寡糖的合成常常需要多種糖基轉(zhuǎn)移酶？一鍋多酶法------42J.Am.Chem.Soc.1995,117,5869-5870一鍋多酶法合成透明質(zhì)酸（hyaluronicacid）E1,hyaluronicacidsynthase;E2,UDP-Glcdehydrogenase;E3,UDP-Glcpyrophosphorylase;E4,UDP-GlcNAcpyrophosphorylase;E5,pyruvatekinase;E6,lactatedehydrogenase;E7,inorganicpyrophosphataseJ.Am.Chem.Soc.1995,117,543sialylLewisX酶法大量合成E1:a1,3-fucosyltransferase；E2:pyruvatekinase；E3:GDP-mannosepyrophosphorylaseE4:GDP-4-keto-5-deoxymannose3,5-epimerase/GDP-4-keto-6-galactosereductase；E5:glucosedehydrogenase；E6:hexokinase；E7:phosphomannomutase；E8:a2,3-sialyltransferase激酶歧化酶sialylLewisXE1:a1,3-fucosy44SuperbeadGalUGalTGalKPyKFRecombinantE.colistratinsoverexpressingGalK,GalT,GalUorPykF1)Fermentation2)Lysis3)AddtoNi2+resinChenX,FangJ,WangPG,etal.:J.Am.Chem.Soc.2001,123,2081-2082.SuperbeadGalUGalTGalKPyKFRecom45Beadswith:GalKGalTGalUPykFPeristalticpumpforcirculationReservoirwith:a1,3GalTLacOBn9.6mMATP 0.96mMPEP 19.2mMUDP 0.96mMGlc-1-P0.96mMGal 12mMMgCl2 10mMMnCl2 10mMKCl 100mMHEPES100mMpH7.5LiuZ,ZhangJ,ChenX,WangPG:ChemBioChem2002,3,348-355.ProductionofUDP-GalwithSuperbeads.Beadswith:PeristalticpumpRes46Superbead用于寡糖合成aGramscalesynthesis,othersare100mgscalesSuperbead用于寡糖合成aGramscales47從多菌種發(fā)酵到

Superbug

從多菌種發(fā)酵到

Superbug

48KyowaHakko’stechnologyforlarge-scaleproductionofUDP-GalandglobotrioseutilizingmetabolicallyengineeredbacterialcellsPpa:pyrophosphataseGalU:glucose-1-phosphateuridylyltransferaseGalT:galactose-1-phosphateuridylyltransferaseGalK:galactokinaseLgtC:a1,4-galactosyltransferaseKyowaHakko’stechnologyforl49CMP-NeuAcregenerationsystembybacterialcouplingUsingthisapproach,sugarnucleotidesincludingUDP-Gal,CMP-Neu5Ac,UDP-GlcNAcandGDP-Fuchavebeensuccessfullyproducedonalargescale.CMP-NeuAcregenerationsystem50Superbugtechnologiesforthesynthesisofa-GalBacteriaNutrientsStartingMaterialsBio-synthetic

pathway

engineeringa-GalSuperbugtechnologiesforthe51分析合成途徑ATPADPGalK:

galactokinaseGalUT:galactose-1-phosphateuridylytransferaseGalU:

glucose-1-phosphate

uridylyltransferasePykF:

pyruvate

kinasea1,3GalT:

a1,3-galactosyltransferasea1,3GalT

Gala1,3LacLactoseUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalUTGalactosePPi分析合成途徑ATPADPGalK:galactokinas52克隆表達(dá)驗(yàn)證相關(guān)酶Cloneandexpressindividualenzymesinthebiosyntheticpathwayofa-Gal（克隆相關(guān)酶）ConstructionanartificialbiosyntheticgeneclusterandtransferintoE.colihostcell.（構(gòu)建基因簇并轉(zhuǎn)化）Largescaleproductionofa-Galoligosaccharidesusingfermentedandpermeatedcells.（發(fā)酵生產(chǎn)）克隆表達(dá)驗(yàn)證相關(guān)酶Cloneandexpressind53pLDR20-aKTUFgalK+galTa1,3GalTgalUpykFT7terminatorlPRpLDR20-aKTUFAmprEcoR

VSac

IISal

IXba

ICla

I~9kblcI-repressorpMB1rbcrbcrbcrbc構(gòu)建多基因表達(dá)質(zhì)粒pLDR20-aKTUFgalK+galTa1,3Gal54檢驗(yàn)多基因表達(dá)效果66,20031,00021,50045,000LysateMIBMPure14,50097,400PykFGalKGalTGalUa1,3GalT檢驗(yàn)多基因表達(dá)效果66,20031,00021,50045,55Superbug整個(gè)生產(chǎn)過程

WholeCellReactionAnalyzedbyTLC,HPLCRt,20-36h

StopbyinsertinginboilingwaterCentrifugationGelfiltrationP21HNMR,13CNMRAnalysis

CultureNM522/pLDR20-aKTUFCentrifugationOverexpressionResuspendedinTris-HClBufferSuperbug整個(gè)生產(chǎn)過程WholeCellRea56E.

coli

NM522pLDR20-aKTUFa-Gal7.2gGal1.1gATP8.4gLac3.6gGlcTotalvolume:1L0.3gUDP-Glc7.2gChenX,LiuZ,ZhangW,FangJ,AndreanaP,WangPG:ChemBioChem.2002,3,47-53.大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)量E.coliNM522pLDR20-aKTUFa-Gal57Superbug-1a1,3GalTGala1,3Galb1,4GlcGalb1,4GlcUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalTGalactoseLactoseGlycolyticpathwayGlucoseATPADPGlucosePyruvatePykFPEPGlycolyticpathwayPPiNM522添加三種原料：glucose,galactose,lactoseSuperbug-1a1,3GalTGala1,3Galb158PpK:polyphosphatekinaseSuperbug-2添加三種原料：多聚磷酸,galactose,lactosePpK:polyphosphatekinaseSuper59ChenX,ZhangJ,KowalP,AndreanaP,WangPG:J.Am.Chem.Soc.2001,123,8866-8867.SusA:sucrosesynthaseGalE:UDP-Gal4-epimerase添加兩種原料：sucrose,lactoseSuperbug-3ChenX,ZhangJ,KowalP,Andr60每次進(jìn)步只有一點(diǎn)點(diǎn)，積累多了才會(huì)實(shí)現(xiàn)自己的目標(biāo)。每次進(jìn)步只有一點(diǎn)點(diǎn)，積累多了才會(huì)實(shí)現(xiàn)自己的目標(biāo)。61二具有生物活性的含糖天然產(chǎn)物及其酶法合成二62含糖天然產(chǎn)物含糖天然產(chǎn)物63含糖天然產(chǎn)物諾加霉素阿克拉霉素(安樂霉素)；蒽環(huán)類抗癌藥，它能嵌入癌細(xì)胞的DNA上，抑制核酸的合成，特別是RNA的合成，為周期非特異性藥物，在G1晚期和S晚期阻斷細(xì)胞周期。daunorubicinn.[微]道諾霉素；紅比霉素；正定霉素；柔毛霉素（用作抗腫瘤藥）含糖天然產(chǎn)物諾加霉素阿克拉霉素(安樂霉素)；蒽環(huán)類抗癌藥，它64含糖天然產(chǎn)物酶法合成TheglycosyltransferaseUrdGT2establishesbothCandOglycosidicbonds天然抗生素竹桃霉素(landomycin)抗菌性與紅霉素類似含糖天然產(chǎn)物酶法合成Theglycosyltransfer65含糖天然產(chǎn)物酶法合成含糖天然產(chǎn)物酶法合成66含糖天然產(chǎn)物酶法合成含糖天然產(chǎn)物酶法合成67含糖天然產(chǎn)物酶法合成含糖天然產(chǎn)物酶法合成68

抗菌黃酮苷化合物

抗菌黃酮苷化合物69抗腫瘤黃酮苷化合物

抗腫瘤黃酮苷化合物70降血脂黃酮苷化合物

降血脂黃酮苷化合物71研究表明，對(duì)于某些黃酮藥物，糖的存在與否會(huì)對(duì)藥效影響很大。例如：diosmin，gossipyn和rutin對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的鎮(zhèn)靜作用，但相應(yīng)的苷元沒有類似作用。桔皮素（tangeratin）是一種非常有效的抗腫瘤細(xì)胞增生的藥物，體外研究表明包括桔皮素在內(nèi)的三種黃酮類藥物它們的糖苷型比苷元型抗腫瘤活性更高。在對(duì)乳腺腺癌細(xì)胞抑制研究中，發(fā)現(xiàn)柚皮苷、蘆丁、芹菜素、山奈酚、白楊素的抑制活性逐漸減弱，含有糖配體的糖苷類物質(zhì)活性比其他的要高些。Europeanjournalofpharmacology,2006，539(3):168-176研究表明，對(duì)于某些黃酮藥物，糖的存在與否會(huì)對(duì)藥效影響很大。例72AcomparisonofthestructuresamongthesecompoundsindicatesthefollowingelementsareessentialtothepotentialacceptorsofUGT78D1:1)the3-hydroxylgroup,2)thedoublebondintheringC,3)the4′-hydroxylgroup.GuangxiangRen,LianwenZhang,GlycoconjJ(2012)29:425–432酶（UGT78D1）的底物選擇性Acomparisonofthestru73阿糖胞苷，急性白血病，糖基部分在抑制核酸代謝物與酶的結(jié)合反應(yīng)中起重要作用，從而增強(qiáng)了其抗腫瘤效應(yīng)。烯二炔類抗腫瘤抗生素通過糖基部分與DNA結(jié)合，使藥物分子嵌入DNA雙螺旋的小溝中(特別是TCCT位點(diǎn))。蒽環(huán)類抗生素，環(huán)A和氨基糖部分在決定藥物與DNA的選擇性結(jié)合中起關(guān)鍵作用。該類藥物與DNA作用形成復(fù)合物的穩(wěn)定性主要決定于藥物的糖環(huán)與DNA之間的作用。以DNA為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物糖配基具有協(xié)助藥物生物轉(zhuǎn)運(yùn)和特異性識(shí)別并結(jié)合DNA的作用。阿糖胞苷，急性白血病，糖基部分在抑制核酸代謝物與酶的結(jié)合反74含糖天然產(chǎn)物或藥物大量存在糖分子在藥物分子執(zhí)行其功能時(shí)有時(shí)具有重要作用人工添加糖分子存在一定困難選擇合適的藥物分子或改造某種功能已知的糖苷藥物，設(shè)計(jì)合成途徑小結(jié)如下：含糖天然產(chǎn)物或藥物大量存在選擇合適的藥物分子或改造某種功75三：糖蛋白藥物三：糖蛋白藥物76正在開發(fā)的蛋白質(zhì)和抗體藥物中大約83%是糖蛋白。 2000-2005(%)2005-2010(%)抗體 35 25蛋白 15 12SmallMolecules 8 8糖蛋白市場(chǎng)發(fā)展速度RevenueInBillions200020052010預(yù)期發(fā)展速度預(yù)計(jì)到2010年，糖蛋白藥品市場(chǎng)可達(dá)680億美元。正在開發(fā)的蛋白質(zhì)和抗體藥物中大約83%是糖蛋白。 77國(guó)際生物藥品市場(chǎng)占有率分析

國(guó)際生物藥品市場(chǎng)占有率分析78蛋白糖基化的作用ProteinfoldingProteintargeting/traffickingLigandrecognition/bindingBiologicalactivityStabilityRegulatesproteinhalf-lifeImmunogenicityglycocomponentofglycoproteins蛋白糖基化的作用ProteinfoldingProtein79美國(guó)Amgen公司的EPOGEN（EPO,紅細(xì)胞生成素）和Aranesp（最新的紅細(xì)胞生成素）：EPOGEN，包含有165個(gè)氨基酸，其序列與天然的內(nèi)源性紅細(xì)胞生成素相同，具有相等的生物活性。Aranesp是第二代紅細(xì)胞生成蛋白，比EPOGEN多兩條N-糖鏈，包含了更多的唾液酸，其體內(nèi)半衰期比EPOGEN長(zhǎng)3倍多，從而顯示出更強(qiáng)的生物活性。美國(guó)Amgen公司的EPOGEN（EPO,紅細(xì)胞生成素）和80目前糖蛋白表達(dá)的缺點(diǎn)和不足非人源化的糖蛋白：糖蛋白的快速清除，改變藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，補(bǔ)體激活，提高免疫原性和用藥安全問題?，F(xiàn)有人源化的糖蛋白：生產(chǎn)成本高，細(xì)胞容易污染，N-糖基化不足，糖基化程度不同（同一批次和不同批次）。SethuramanN,StadheimTA.Challengesintherapeuticglycoproteinproduction.CurrOpinBiotechnol.2006.17(4):341-6.目前糖蛋白表達(dá)的缺點(diǎn)和不足非人源化的糖蛋白：糖蛋白的快速清除81摻入非天然氨基酸特定化學(xué)反應(yīng)引入糖基修飾摻入非天然氨基酸82細(xì)胞表達(dá)復(fù)雜糖修飾蛋白特定酶切（Endo-H）、酶連（Endo-A/M）引入均一糖鏈細(xì)胞表達(dá)復(fù)雜糖修飾蛋白特定酶切（Endo-H）、酶連（83四：糖疫苗病原微生物耐藥性逐漸變強(qiáng)，需要更安全有效的防治方法多種微生物表面成分可作為疫苗Inprinciple,varioustypesofcellsurfaceepitopes,characteristic

fortheinvadingorganismorrelatedtoaberrantgrowthofcells,canbeappliedtodevelopvaccines.糖合成技術(shù)的出現(xiàn)為糖疫苗的研究應(yīng)用提供了可能Theprogressinestablishingthestructureofcarbohydrateimmuno-determinantsinconjunctionwithimprovementsincarbohydratesynthesishasrendereditfeasibletodevelopnewgenerationsofcarbohydrate-basedvaccines.四：糖疫苗病原微生物耐藥性逐漸變強(qiáng)，需要更安全有效的防治84部分已知糖蛋白抗原部分已知糖蛋白抗原85糖疫苗結(jié)構(gòu)Carrierprotein:KLH(keyholeLimpethemocyanin)DT(diphtheriatoxoids，CRM197))TT(tetanusToxoids)antigen

protein

Glycan(起免疫作用的只是糖鏈的一部分；oligosaccharides------有機(jī)合成或多糖降解獲得)CouplingBifunctionalspacermolecules(amino,carboxylorthiolgroups)糖疫苗結(jié)構(gòu)Carrierprotein:86Glycoconjugatevaccinesagainstbacterialinfections基于細(xì)菌莢膜多糖上的片段，如下列病原微生物：研究?jī)?nèi)容：糖鏈長(zhǎng)度與疫苗功能；糖鏈數(shù)目與免疫功能Polysaccharidetype-3relateddi-,tri-andtetrasaccharride-CRM197conjugates:S.pneumoniaetype3infectionoligosaccharide/proteinratios肺炎球菌奈瑟氏腦膜炎球菌流感嗜血桿菌傷寒沙門氏菌痢疾志賀氏菌B型鏈球菌肺炎桿菌Glycoconjugatevaccinesagains87偶聯(lián)多條糖鏈更有效偶聯(lián)多條糖鏈更有效88病原微生物糖疫苗抗寄生蟲疫苗制備更復(fù)雜.Malaria(瘧疾),toxoplasmosis（弓形體?。゛ndleishmanias（利什曼蟲）.MalariacausedbyPlasmodiumfalciparum（瘧原蟲）,靶點(diǎn)：對(duì)應(yīng)前兩者為glycosylphosphatidylinositolanchors(GPIs)偶聯(lián)于KLH獲得疫苗，對(duì)瘧疾有很好的防治效果。病原微生物糖疫苗抗寄生蟲疫苗制備更復(fù)雜.偶聯(lián)于KLH獲得疫苗89腫瘤糖疫苗至今FDA只批準(zhǔn)了一個(gè)預(yù)防肝炎病毒的疫苗腫瘤糖疫苗至今FDA只批準(zhǔn)了一個(gè)預(yù)防肝炎病毒的疫苗90糖相關(guān)腫瘤抗原Muc-1NER-2/neuCEAP53STnGloboH糖相關(guān)腫瘤抗原91糖苷酶及其應(yīng)用糖苷酶及其應(yīng)用92Glycosidehydrolases(Glycosidases)TransglycosylasesLyasesphosphorylases糖鏈或糖綴合物糖苷鍵天然水解時(shí)，半衰期為470萬年；糖苷酶可以提高催化效率10的17次方倍。糖苷鍵切割相關(guān)酶糖苷鍵底物及效率Glycosidehydrolases(Glycosid93糖苷酶分類按水解機(jī)理：保持型&翻轉(zhuǎn)型按糖苷鍵位置：內(nèi)切酶，外切酶（非還原端外切酶，還原端外切酶）糖苷酶分類按水解機(jī)理：94包括近13萬條糖苷酶序列，分屬130個(gè)家族(sequence-basedfamilies,rs-mrs.fr/CAZY)超過30種糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析Transglycosidases(transglycosylases):在寡糖和多糖之間進(jìn)行糖基化反應(yīng)。根據(jù)序列進(jìn)行分類（EC3.2.1.-）包括近13萬條糖苷酶序列，分屬130個(gè)家族(sequen95某些保持型糖苷酶（唾液酸轉(zhuǎn)移酶），活性中心可以包含一個(gè)酪氨酸某些保持型糖苷酶的酶促反應(yīng)中，有鄰基參與過程某些保持型糖苷酶（唾液酸轉(zhuǎn)移酶），活性中心可以包含一個(gè)酪氨酸96Myrosinases(芥子苷酶)Myrosinases(芥子苷酶)97Lyases(裂解酶)通過消去反應(yīng)的機(jī)制（eg:a-glucanlyases）Lyases(裂解酶)通過消去反應(yīng)的機(jī)制（eg:a-glu98Phosphorylase&TransglycosidasesA-R+H3PO3-----A-H2PO3+RH“磷解”糖苷鍵產(chǎn)物：sugar-1-P(retentionorinversion)通常為外切酶（如glycogenphosphorylase)）經(jīng)過糖苷-酶過渡態(tài)，糖的羥基親和進(jìn)攻合成新的糖苷鍵“糖解”糖苷酶（環(huán)糊精合酶）TransglycosidasesPhosphorylasePhosphorylase&Transglycosida99水解機(jī)理都要經(jīng)歷鎓離子過渡態(tài)；而且活性中心包含了兩個(gè)酸性氨基酸（一般為谷氨酸和天冬氨酸）Invertingglycosidase:AsingledisplacementmechanismRetainingglycosidase:Adoubledisplacementmechanism水解機(jī)理都要經(jīng)歷鎓離子過渡態(tài)；而且活性中心包含了兩個(gè)酸性氨基100親和標(biāo)記試劑：用于研究特定的活性位點(diǎn)氨基酸殘基。2-脫氧-2-氟糖；5-氟糖。機(jī)制：通過鎓離子過渡態(tài)去穩(wěn)定化實(shí)現(xiàn)。Mechanism-based,time-dependentinhibitorsofretainingglycosidehydrolases.糖苷酶研究工具親和標(biāo)記試劑：用于研究特定的活性位點(diǎn)氨基酸殘基。2-脫氧-2101Time-dependentcovalentinactivatorsofglycosidehydrolasesbicyclicinactivatorsofglycosidehydrolasesTime-dependentcovalentinacti102Non-covalentglycosidehydrolaseinhibitorsNitrogen-containing‘sugar-shaped’heterocycles.HavinggreateractivitytowardsinvertingglucosidehydrolasesratherthanretainingonesNon-covalentglycosidehydrola103(不可水解的底物類似物)（雜環(huán)糖類似物）(不可水解的底物類似物)（雜環(huán)糖類似物）104糖苷酶在合成中的應(yīng)用可逆反應(yīng)為其應(yīng)用于合成提供了理論基礎(chǔ)熱動(dòng)力學(xué)控制（hydrolysisisexothermicprocess）糖苷酶在合成中的應(yīng)用可逆反應(yīng)為其應(yīng)用于合成提供了理論基礎(chǔ)105自身轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)溫度有關(guān)；缺點(diǎn)：六位碳羥基產(chǎn)生的副反應(yīng)保持型/翻轉(zhuǎn)型？自身轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物與反應(yīng)溫度有關(guān)；保持型/翻轉(zhuǎn)型？106動(dòng)力學(xué)控制（只適用于應(yīng)用活化中間體的酶，保持型水解酶）動(dòng)力學(xué)控制（只適用于應(yīng)用活化中間體的酶，