大專生物化學專題一膠原蛋白的提取資料課件

專題一膠原蛋白的提取生物化學實用技術2012.3專題一膠原蛋白的提取生物化學實用技術1膠原蛋白是一種極其重要的結構蛋白，廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。占哺乳動物體內蛋白質總量的25%~30%，相當于體重的6%至少有19種不同的類型膠原蛋白概述膠原蛋白是一種極其重要的結構蛋白，廣泛存在于動物的骨、腱、肌2一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質通常由3條多肽鏈組成，每條鏈都有左手螺旋結構，三條鏈繞成右手超螺旋。螺旋區(qū)段之外的部分常發(fā)生各種交聯(lián)。每一條鏈都有若干個典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-)n。X、Y均表示任意的氨基酸,X通常是脯氨酸(Pro),Y通常指羥脯氨酸(Hyp)膠原蛋白中缺少Cys和Try膠原蛋白的組成與結構膠原蛋白的組成與結構3制造食品止血，促進傷口愈合作為可吸收的支架材料、縫合材料作為藥物載體局部整形膠原蛋白的應用制造食品膠原蛋白的應用4從膠原蛋白較為豐富的組織（例如皮膚和肌腱）中提取傳統(tǒng)來源：豬牛羊皮新興來源：魚鱗等問題一：如何從原料中提取蛋白？問題二：如何從蛋白中分離膠原蛋白？問題三：如何檢驗得到的蛋白是膠原蛋白？膠原蛋白的提取從膠原蛋白較為豐富的組織（例如皮膚和肌腱）中提取膠原蛋白的提5前處理粗分級（粗提）細分級（分離純化）問題一：蛋白提取的步驟？作業(yè)一：某一特定蛋白質分離提純的一般程序是什么？前處理問題一：蛋白提取的步驟？作業(yè)一：某一特定蛋白質分離提純6破碎組織細胞，使蛋白更好地與外界條件接觸盡量保持蛋白的天然構象和生物活性注意控制條件必要時加入蛋白保護劑可以先將某一細胞組分分離出來前處理動物材料：除脂肪組織---電動搗碎機、勻漿器、

超聲波植物組織：去種皮---石英砂、玻璃粉細菌細胞：超聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶破碎組織細胞，使蛋白更好地與外界條件接觸前處理動物材料：除脂7稱取新鮮豬皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液對其進行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細切。將用蒸餾水洗滌后的組織小塊放入高速組織搗碎機中搗碎成糊狀（12000r/min），用含4.5mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）充分洗滌以去除脂質及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4OC）。膠原蛋白提取的前處理稱取新鮮豬皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液對其進行脫脂8第一步：將蛋白與材料分開，使其進入溶液中酸溶堿溶鹽溶酶解粗分級注意根據(jù)所要提取的蛋白質的性質選擇合適的粗分級方法第一步：將蛋白與材料分開，使其進入溶液中粗分級注意根據(jù)所要提9提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.15~2mol/LNaCl)或是稀醋酸溶液。前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在2~3之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質量，取決于處理時間以及堿的濃度。酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水膠原蛋白提取的粗分級提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.15~2mol/LNaCl)或是稀醋酸溶液。前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在2~3之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質量，取決于處理時間以及堿的濃度。酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水膠原蛋白提取的粗分級提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.15~2mol/L10粗分級第二步：用簡便且處理量大的方法去除無機物等雜質，得到濃縮蛋白質溶液鹽析等電點沉淀法有機溶劑沉淀法超濾如蛋白相互差異較大，也可初步分離目標蛋白

可逆沉淀粗分級第二步：用簡便且處理量大的方法去除無機物等雜質，得到濃11鹽析法(中性鹽沉淀法)：向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽,使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀。常用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。有機溶劑沉淀法：常用與水互溶的有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。

★蛋白質的等電點：蛋白質所帶凈電荷為零時，所處溶液的pH值即為該蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質最不穩(wěn)定，溶解度最小。鹽析法(中性鹽沉淀法)：向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽,使蛋12超濾法利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對生物大分子溶液進行過濾，使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質及水過濾出去，從而達到脫鹽或濃縮的目的。超濾法利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對生物大分子溶液進行過13細分級進一步分離純化目標蛋白質透析超濾凝膠過濾/層析/離子交換色譜密度梯度離心電泳等電聚焦細分級進一步分離純化目標蛋白質14在粗提膠原蛋白溶液中緩慢加入6mol/LNaOH至pH=7，冷凍離心去除沉淀，在上清液中加入NaCl攪拌，4℃保存過夜；離心取沉淀，用稀HAc溶解，將溶液裝入透析袋中，用0.1mol/L的Hac透析1天，再用蒸餾水透析1天。膠原蛋白的提純在粗提膠原蛋白溶液中緩慢加入6mol/LNaOH至pH=15透析法透析法16電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電極移動的現(xiàn)象不同的蛋白質顆粒的大小、形狀、所帶的電荷、等不同，在電場中的泳動速度各異，因而可聚集形成不同的條帶，從而達到分離的目的。

電泳法電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電極移動的現(xiàn)象電泳法17

電泳法電泳法18膠原蛋白的電泳圖膠原蛋白的電泳圖19層析法：①離子交換層析法②凝膠過濾層析法③親和層析法④吸附層析法⑤分配層析法層析法：①離子交換層析法20①離子交換層析法①離子交換層析法21原理:根據(jù)離子交換劑與蛋白質進行離子交換，再利用適當?shù)木彌_液洗脫，即可達到分離具有不同電荷性質蛋白質的目的。原理:22②凝膠過濾層析法

(排阻層析，分子篩層析)②凝膠過濾層析法

(排阻層析，分子篩層析)23原理：

混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內部具有大量一定大小的微孔）的層析柱時，大分子不能進入凝膠孔內，移動較快，并最先被洗脫出來；小分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經(jīng)過的路程較長，移動速度較慢，最后被洗脫出來。原理：24③親合層析法親和蛋白配基③親合層析法親和蛋白25原理：利用某種蛋白質能與其相應的專一性