細(xì)胞破碎方法對釋放乙醛脫氫酶的影響

細(xì)胞破碎方法對釋放乙醛脫氫酶的影響

乙醇在人體的代謝主要依賴于兩個(gè)酶中的酶，一個(gè)是乙醇脫氫酶（adh），另一個(gè)是乙醛脫氫酶（adh）。前者使乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛,后者使乙醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸,最終分解為二氧化碳和水。人體中,一般都存在前一種酶,而且數(shù)量基本是相等的。但缺少后一種酶的人就比較多,ALDH的缺少,使乙醇不能被完全分解為水和二氧化碳,而是以乙醛的形式繼續(xù)留在體內(nèi)。有資料表明,乙醛在人體內(nèi)的過度堆積是醉酒的主要原因。目前,ALDH主要是從動物的肝臟、胰腺或肝細(xì)胞線粒體中分離提取,但其資源有限且價(jià)格昂貴,因此很難大規(guī)模生產(chǎn)。為了拓展ALDH的來源,國內(nèi)外科學(xué)工作者開始探索從微生物細(xì)胞中提取ALDH,國外在此方面已做了大量的工作,并得到活性較高的ALDH。國內(nèi)還沒有見到從微生物細(xì)胞中提取ALDH的報(bào)道。因此,通過微生物的發(fā)酵、分離純化ALDH,具有很大的市場前景。從酵母中分離提純ALDH是一個(gè)較為復(fù)雜的過程,ALDH為胞內(nèi)產(chǎn)物,大部分存在于線粒體中,其他存在于胞液中,首先必須將細(xì)胞破壁,使產(chǎn)物得以釋放,才能進(jìn)一步提取。成熟的酵母菌細(xì)胞壁較厚,不易被破碎,而且ALDH對溫度及酸堿度很敏感,容易失活。因此尋找一種既能高效破碎酵母細(xì)胞,又能有效維持ALDH穩(wěn)定性的方法是非常必要的。本文對攪拌、珠磨、高壓細(xì)胞破碎儀和高壓破碎儀破碎酵母細(xì)胞釋放ALDH進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,為從酵母中分離提取ALDH作準(zhǔn)備。1材料和方法1.1evisiaeacy2c2模型菌種釀酒酵母AY92022(SaccharomycescerevisiaeAY92022);斜面培養(yǎng)基蛋白胨2%,酵母膏1%,葡萄糖2%,瓊脂2%,pH6.0;液體培養(yǎng)基蛋白胨0.5%,酵母膏0.3%,麥芽汁0.3%,pH5.5。1.2離心液處理細(xì)胞培養(yǎng)液制備將酵母菌種接種于斜面培養(yǎng)基中,在30℃恒溫箱中培養(yǎng)12h后,再將菌種接種于液體培養(yǎng)基中,于30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)17h。取細(xì)胞培養(yǎng)液離心(6000r/min,5min),棄去上清液得到沉淀,用蒸餾水洗滌2~3次。取菌體細(xì)胞,加入含有5%50mmol/LpH8.0的Tris-Cl、0.2%1mmol/L的EDTA、2%100mmol/L的NaCl的緩沖溶液,用四種不同的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎,離心后取上清液測蛋白質(zhì)含量和乙醛脫氫酶(ALDH)的活力。1.3細(xì)胞破碎法1.3.1提取一段時(shí)間水浴鍋中保溫2h,不斷攪拌,再于室溫中不斷攪拌提取一段時(shí)間。將溶有菌體的緩沖溶液在37℃水浴鍋中保溫2h,不斷攪拌,再于室溫中不斷攪拌提取一段時(shí)間。1.3.2振蕩懸液制備取溶有菌體的緩沖溶液500μL,加入用酸洗過的玻璃珠至其總體積為1.25mL,在旋渦混合儀上劇烈振蕩懸液1min數(shù)次,每次間歇期間將懸液置于冰浴中冷卻1min。1.3.3高壓細(xì)胞破碎法1.3.4高壓破碎法1.4蛋白質(zhì)含量測定采用紫外分光光度計(jì)通過比色來測定蛋白質(zhì)的含量。1.5乙醇脫氫酶aldh活性測定[5.8]在340nm處測定ALDH催化乙醛脫氫生成乙酸所用的酶量。定義每分鐘A340nm增加0.001為1個(gè)活力單位(U)。2結(jié)果與討論2.1時(shí)酶活力測定圖1表示攪拌粗提對蛋白質(zhì)含量及ALDH活性的影響,室溫?cái)嚢?h時(shí)酶活力最大;在0~3h時(shí),蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的增大而增大;在3h以后,蛋白質(zhì)含量已增加不多。由于ALDH大部分存在于酵母細(xì)胞的線粒體中,攪拌粗提時(shí)不能充分釋放到胞外,從而酶的活力很低。2.2破碎離心后上清液蛋白質(zhì)含量的變化在含有酵母菌體的緩沖液中加入酸洗過的玻璃珠,置于旋渦混合儀上劇烈振蕩數(shù)次,每次振蕩1min后間歇1min,間歇期間將懸液放在冰浴中冷卻,防止溫度過高使ALDH失活。由圖2可以看出,破碎離心后上清液中蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的增加而增大,振蕩40min時(shí),蛋白質(zhì)含量將增加不多。ALDH活力隨振蕩時(shí)間先是增大后是減小,在30min時(shí)達(dá)到最大。2.3酵母細(xì)胞的制備采用NiroSoavi提供Panda2K實(shí)驗(yàn)室級高壓細(xì)胞破碎儀來破碎酵母細(xì)胞。它可以在高達(dá)1500bar的壓力下連續(xù)處理各種粘度的物料。它的殘留量小,每分鐘處理量為165mL。這種高壓細(xì)胞破碎儀能夠破碎微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞及組織,它能連續(xù)、穩(wěn)定、持久地工作,有一定的破碎效果。2.3.1輸出壓力對其破碎的影響在固定循環(huán)次數(shù)為2時(shí),考察不同壓力下的破碎情況,結(jié)果如圖3所示。從圖3可知,高壓細(xì)胞破碎儀的壓力對破碎效果有很大影響,隨輸出壓力的增大,破碎的作用增強(qiáng),但壓力提高至1100bar時(shí),蛋白質(zhì)含量增加已不明顯。在0~1100bar時(shí)酶的活力隨壓力的增加而增大;在1100~1400bar時(shí),酶的活力有下降趨勢,說明酶的活性有損失。由圖3可以看出,壓力為1100bar時(shí)酶活力最高。2.3.2循環(huán)次數(shù)對蛋白質(zhì)含量的影響在固定壓力為1100bar時(shí),考察不同循環(huán)次數(shù)下的破碎情況,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,蛋白質(zhì)含量隨循環(huán)次數(shù)的增加而增大,但循環(huán)3次時(shí),蛋白質(zhì)含量增加不多。ALDH的活力隨循環(huán)次數(shù)的增多先增大后減小,從圖4可以看出,循環(huán)次數(shù)為3時(shí)酶活力最高。2.4shct破碎率的測定采用ConstantSystems公司生產(chǎn)的oneshot高壓破碎儀破碎酵母細(xì)胞。Oneshot型號是一種用于研究用途的破碎儀,被廣泛用于處理小量樣品,能夠處理流動、粘性不能流動的樣品。每個(gè)循環(huán)(shot)處理時(shí)間是25s,每shot的處理量與最大的力頭有關(guān),一般處理量為7~8mL。本實(shí)驗(yàn)采用功率為0.75kW、壓力為40000PSI(2700bar),經(jīng)25s一次性破碎。由圖5可以看出,破碎率能達(dá)到95%以上。破碎后蛋白質(zhì)含量為2.892mg/mL,ALDH的活力為27.4U。2.5高壓細(xì)胞破碎法破碎蛋白質(zhì)和酶活力圖6對四種不同破碎方法進(jìn)行了比較。由圖6可以看出,攪拌破碎和珠磨破碎后的蛋白質(zhì)含量及酶的活力均較低,高壓細(xì)胞破碎儀破碎后的蛋白質(zhì)的含量和酶的活力較高,但比活力低于高壓破碎儀。采用高壓破碎儀進(jìn)行破碎,蛋白質(zhì)的含量較高,而酶的活力大大高于其它的破碎方法,是一種較為理想的破碎方法。3高壓細(xì)胞破碎法攪拌粗提破碎酵母細(xì)胞,表面上看很經(jīng)濟(jì),但操作需要保溫設(shè)備而且破碎效率很低,因此所得乙醛脫氫酶的活性也很低;珠磨法破碎酵母細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍,處理少量樣品時(shí)操作簡便,液量損失少,但是由于處理樣品量太少,很難用來做下一步的分離提純;NiroSoavi提供的Panda2K實(shí)驗(yàn)室級高壓細(xì)胞破碎儀是特別適用于各種不同流體的乳化均質(zhì)實(shí)驗(yàn),它用于細(xì)胞破碎要連續(xù)多次循環(huán)操作才有較好的效果,而且操作不夠簡便,產(chǎn)生較多熱量,使某些敏感性活性物質(zhì)失活;ConstantSystems公司生產(chǎn)的oneshot高壓破碎儀能夠破碎微生