植物蛋白質的提取和含量測定

一、實驗目的(mùdì)掌握大豆蛋白的提取及制備大豆蛋白丙酮干粉的方法。第二頁，共九頁。二、實驗原理大豆蛋白主要是酸性蛋白，，能溶于堿溶液本實驗先利用稀堿提取(tíqǔ)大豆蛋白，再利用丙酮結合等電點溶解度最低原理沉淀蛋白。2.Folin-酚法測定蛋白質含量酚試劑由兩部分組成，試劑A為雙縮脲試劑，可與肽鏈發(fā)生顯色反應，試劑B中的磷鉬酸和磷鎢酸在OH-條件下不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原顯藍色，因蛋白質中含Tyr被還原成藍色，顏色深淺與濃度成正比，可用比色法測定。第三頁，共九頁。三、實驗器材分光光度計（500nm），比色皿計算(jìsuàn)紙（9cm×9cm）離心機（離心管100ml、50ml）組織搗碎機精密pH試紙第四頁，共九頁。四、實驗試劑1.大豆干粉2.0.2%NaOH3.丙酮（預冷）4.6MHCl，1MHCl5標準BSA（0.5mg/ml）6.Folin—酚試劑甲（用前組分(zǔfèn)一:組分(zǔfèn)二=50:1）（1）1克Na2CO3和0.2克NaOH溶解于50毫升蒸餾水中。（2）0.5克硫酸銅（CuSO4?5H2O）溶解100毫升1%酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O）中。

每次使用前，將50ml（1）與1ml（2）混合，即為試劑甲。第五頁，共九頁。四、實驗試劑7.Folin—酚試劑乙（用前稀釋一倍） 在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4?2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結束時，加入150克硫酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅除(qūchú)過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。第六頁，共九頁。五、實驗步驟（一）蛋白提取1.稱取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH30毫升。（先加入調成糊狀，再用少量多次地慢慢地加入（邊加邊攪拌），室溫下攪拌抽提10min，于4000r/min離心7min,小心留取上清液，棄脂層和沉淀，如上清液有漂浮物，再經過濾；2.留出上清液2毫升稀釋50倍做含量測定（第二步）3.制干粉：量剩余上清液的體積，加入等體積預冷丙酮，先用6mol/L的HCl調pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心調pH至，于4000r/min離心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反復(至少兩次)攪拌洗滌（在離心管中進行），加入丙酮后一定將沉淀攪拌充分，使沉淀脫水。得到白色(báisè)粉末狀的大豆蛋白粉，用干凈的濾紙吸干、平鋪在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整個實驗結束后，再稱重并計算產率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。第七頁，共九頁。五、實驗步驟（二）蛋白含量測定1.制作標準曲線按照下表操作，以A500nm為縱坐標，以蛋白含量為橫坐標建立標曲。2.測定提取第2步稀釋后樣品的蛋白濃度按上表(shànɡbiǎo)中樣品列操作，根據A500nm查找含量，并計算原始濃度。

第八頁，共九頁。內容(nèiróng)總結植物蛋白質的提取(tíqǔ)和含量測定。計算紙（9cm×9cm）。精密pH試紙pH0.5-5.0。7.Folin