分子診斷學(xué) 復(fù)雜性疾病的分子診斷課件

Chapter

16遺傳性疾病的分子診斷1.

Molecular

pathology

represents

theapplication

of

the

principles

of

basicmolecular

biology

to

the

investigation

ofhuman

disease

processes.molecular

pathology：分子病理學(xué)Key

Points2.

Gene

mutation

and/or

geneticpolymorphism

is

a

normal

occurrence,usually

without

grave

consequences,

thatcontributes

to

those

traits

that

establishour

individuality.genetic

polymorphism：基因多態(tài)性3.According

to

numerous

informationavailable,genetic

diseases

can

becategorized

intothree

major

groups:chromosomal

disorders,monogenic

orsingle-gene

disorders,andpolygenic

ormultifactorial

disorders.

chromosomal：染色體；monogenic/single-gene：?jiǎn)位颍籶olygenic/multifactorial多基因4.

Polygenic

or

multifactorial

disorders

resultfrom

multiple

genetic

and/or

epigeneticfactors

that

do

not

conform

to

traditionalMendelian

inheritance

pattens,

which

aredifferent

in

monogenic

disorders.epigenetic：后生的；Mendelianinheritance：孟德?tīng)栠z傳；5.The

pathogenicnature

of

methylation

isillustrated

by

the

observation

that

for

manytumor

suppressor

genes.

methylation：甲基化；pathogenic：病原的

Hybridization：雜交6.

The

detection

ofmethylated

sequencesinDNA

derived

fromthe

plasma

or

serum

byall

kinds

of

sensitive

techniques

is

apotentially

important

early

detection

andmonitoring

method

for

cancer.plasma

or

serum：血漿或血清

potentially：潛在地7.DNA

alterationshave

been

detectedinpatients

with

small

or

even

in

situ

lesions,indicating

that

tumor

DNA

is

shed

intocirculation

early

in

the

disease.alterations：改變，更改；in

situ：在原來(lái)的位置；

lesion：機(jī)能障礙；8.Our

ever

broadening

insights

intothemolecular

basis

of

disease

processescontinue

to

provide

an

opportunity

for

theclinical

laboratory

to

develop

andimplement

new

and

novel

approaches

fordiagnosis,monitoring,drug

resistance

andprognostic

assessment

of

human

diseases.Implement：實(shí)施；prognostic：預(yù)兆復(fù)雜性疾病包括腫瘤（tumor）、心血管疾?。╟ardiovasculardiseases）、自身免疫性疾?。╝utoimmune

diseases）和一些代謝性疾?。╩etabolic

diseases）等。腫瘤（tumor）：醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)亦稱惡性腫瘤（malignant

neoplasm），由控制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖機(jī)制失常而引起的疾病。癌細(xì)胞除了生長(zhǎng)失控外，還會(huì)局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分。分子生物學(xué)的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2.5萬(wàn)多種與癌癥相關(guān)的基因變異，這個(gè)數(shù)字還在增加心血管疾病（cardiovasculardiseases）：心血管疾病是威脅人類健康的最常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率在中國(guó)居于首位自身免疫性疾?。╝utoimmunediseases）：是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。代謝性疾?。╩etabolic

diseases）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后在體內(nèi)合成和分解代謝過(guò)程中的一系列化學(xué)反應(yīng)，如某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙則引起代謝性疾病Section

1

復(fù)雜性疾病的分子診斷策略a

復(fù)雜性疾病分子診斷的定義和原理復(fù)雜性疾病（complicated

diseases）基本特征：發(fā)病原因不明，由多個(gè)基因和環(huán)境因素共同參與，不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，當(dāng)出現(xiàn)典型臨床表現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于病程的中后期。復(fù)雜性疾病分子診斷的特點(diǎn)：1.直接檢測(cè)疾病或疾病相關(guān)基因，屬病因診斷，針對(duì)性強(qiáng)。特異性強(qiáng)，靈敏度高。適用范圍廣。b

復(fù)雜性疾病分子診斷常用的檢測(cè)標(biāo)本患者的外周血細(xì)胞

病灶局部的受損組織血漿DNA血漿DNA（plasma

DNA），又稱循環(huán)DNA（circulating

DNA），是一種無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外

DNA，由長(zhǎng)度不等的單鏈或雙鏈DNA組成。

根據(jù)核苷酸序列的組成差異性，可分為：①人類基因組來(lái)源的循環(huán)DNA；②細(xì)菌及病毒等病原生物來(lái)源的循環(huán)DNA人類基因組循環(huán)DNA來(lái)源于：①細(xì)胞死亡后釋放的DNA片段；②細(xì)胞主動(dòng)分泌或釋放的DNA片段c

分子診斷的常用方法與思路分子雜交（molecular

hybridization）不同來(lái)源或不同種類生物分子間相互特異識(shí)別而發(fā)生的結(jié)合。如核酸(DNA、RNA)之間、蛋白質(zhì)分子之間、核酸與蛋白質(zhì)分子之間、以及自組裝單分子膜之間的特異性結(jié)合。PCR（polymerase

chain

reaction）DNA序列分析基因芯片1.基因結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)：①斑點(diǎn)雜交（dot

blot

hybridization）②等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotide,ASO）?單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）④限制性內(nèi)切酶圖譜（restriction

map）⑤限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction

fragment

lengthpolymorphism,RFLP）⑥D(zhuǎn)NA印跡（Southern

blot）2.基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)：?RNA印跡（Northern

blot）?逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）3.基因序列分析及表達(dá)檢測(cè)技術(shù)?DNA序列分析?基因芯片Section

2

腫瘤的分子診斷基因和蛋白質(zhì)水平改變，其發(fā)生發(fā)展存在一定的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，以此作為腫瘤分子診斷的依據(jù)a

腫瘤的發(fā)病機(jī)制1.階梯式遺傳學(xué)疾病2.表觀遺傳學(xué)改變Classicalgenetics表觀遺傳學(xué)研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳變化的，或者說(shuō)是研究從基因演繹為表型的過(guò)程和機(jī)制的一門(mén)新興的遺傳學(xué)分支。表觀遺傳所謂表觀遺傳就是不基于DNA差異的核酸遺傳。即細(xì)胞分裂過(guò)程中，DNA

序列不變的前提下，全基因組的基因表達(dá)調(diào)控所決定的表型遺傳，涉及染色質(zhì)重編程、整體的基因表達(dá)調(diào)控（如隔離子，增強(qiáng)子，弱化子，

DNA甲基化，組蛋白修飾等功能),及基因型對(duì)表型的決定作用。表觀遺傳學(xué)的研究?jī)?nèi)容：基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控基因組中非編碼RNA微小RNA（miRNA）反義RNA內(nèi)含子、核糖開(kāi)關(guān)等基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控DNA甲基化基因印跡組蛋白共價(jià)修飾染色質(zhì)重塑組蛋白修飾2染色質(zhì)重塑3RNA

調(diào)

控4DNA

甲基化1DNA甲基化(methylation)(DNA

甲基化一般與基因的沉默silence)相關(guān)，非甲基化(non-methylation)

一般則與基因的活化

(geactivation)相關(guān)，而去甲基化

(demethylation)往往是與一個(gè)沉默基因的重新激活(reactivation)相關(guān)DNA甲基化對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)具有重要作用，并且與X染色體的失活、基因印跡和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。3.基因變異基因異常表達(dá) 腫瘤因此可以將特定腫瘤的基因表達(dá)標(biāo)記，應(yīng)用到腫瘤診斷、分型和對(duì)治療反應(yīng)性的預(yù)測(cè)當(dāng)中。A.癌基因（oncogene）：能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因原癌基因（pro-oncogene）或細(xì)胞癌基因（c-onc）按照癌基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其在細(xì)胞內(nèi)的定位，癌基因可以分為五大類：①生長(zhǎng)因子類②酪氨酸激酶類?GTP結(jié)合蛋白類④核蛋白類⑤端粒酶（telomerase）P264B.癌基因的活化機(jī)制：①轉(zhuǎn)導(dǎo)：漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化過(guò)程中，正常基因整合癌基因②點(diǎn)突變?插入突變④易位⑤基因擴(kuò)增⑥基因甲基化改變C.抑癌基因：一對(duì)等位基因由于其功能的喪失，從而使細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)增殖，導(dǎo)致腫瘤形成。這一對(duì)等位基因即為抑癌基因。主要包括兩個(gè)方面：①抑癌基因必須是一對(duì)等位基因同時(shí)是失活的；②wild-type導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞，體外培養(yǎng)可以抑制細(xì)胞增殖常見(jiàn)的抑癌基因：Rb基因、p53基因、APC基因、BRCA1基因、

WT1基因、erbA基因、INK4基因、p21clip1基因基因變異DNA損傷及其分子改變基因組不穩(wěn)定性染色體異常微衛(wèi)星不穩(wěn)定性b

腫瘤早期分子診斷及預(yù)后1.腫瘤早期診斷的策略：考慮因素：①特殊類型腫瘤的靶基因；②不同腫瘤特定靶基因的突變譜；③共檢測(cè)使用的合適樣本；④分子診斷技術(shù)的敏感性I.

檢測(cè)標(biāo)本的選擇：多選擇含有患者腫瘤細(xì)胞來(lái)源基因信息的體液、分泌物或排泄物作為臨床腫瘤分子診斷的檢測(cè)樣本，如血、痰及大便等II.

檢測(cè)樣本的處理：①重復(fù)離心法：EDTA抗凝血→4

℃1500r/mincentrifuge

20min→上層血漿