高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品肌肉中磺酸類化合物殘留量

高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品肌肉中磺酸類化合物殘留量

1妊娠合并用藥藥物使用中的藥物殘留會(huì)導(dǎo)致環(huán)境危害和“三病”（致殘、畸形、突變）等問(wèn)題。磺胺類藥物(sulfonamides,SAs)作為應(yīng)用廣泛的抗菌素,由于其具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌作用,常被用作水產(chǎn)飼料添加劑廣泛地添加到飼料中,但是由于SAs在人體內(nèi)蓄積到一定程度時(shí),有嚴(yán)重的毒副作用,會(huì)破壞人的正常免疫機(jī)能和造血系統(tǒng),損害人體泌尿系統(tǒng)、腦神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等,引起過(guò)敏反應(yīng),誘發(fā)人的甲狀腺腫瘤,出現(xiàn)頭暈、頭痛、全身乏力、惡心、嘔吐等癥狀;SAs還可穿過(guò)血胎盤屏障至胎兒體內(nèi),妊娠后期使用SAs,可出現(xiàn)黃疸和核黃疸,并且有“三致”的可能性。飼料中SAs過(guò)量,對(duì)動(dòng)物肌體也有損害并影響生產(chǎn)性能。因此,磺胺類藥物的殘留問(wèn)題倍受關(guān)注。根據(jù)農(nóng)業(yè)部的部署,從2005年起,將把畜產(chǎn)品中磺胺類藥物的殘留情況作為繼瘦肉精之后的又一個(gè)重點(diǎn)予以監(jiān)控。因此,研究磺胺類藥物的殘留與檢測(cè)方法是關(guān)系到畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要問(wèn)題。SAs主要是氨基苯磺酰胺的一類衍生物,包括SMR、SDD、SMM、SDM和SQX,結(jié)構(gòu)如圖1所示。1932年人們發(fā)現(xiàn)含有磺酰胺基的偶氮染料“百浪多息”對(duì)鏈球菌和葡萄球菌有很好的抑制作用,對(duì)溶血性鏈球菌及其它細(xì)菌感染的疾病有明顯療效,這在國(guó)際上受到重視且被深入的研究。SAs—般為白色或淡黃色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,無(wú)臭,幾乎無(wú)味。因其結(jié)構(gòu)中帶有苯環(huán),各種SAs均具有紫外吸收的特性。利用SAs的特性發(fā)展起來(lái)的HPLC;檢測(cè)方法,是一項(xiàng)高效、快速的分析分離技術(shù),現(xiàn)在使用仍很廣泛。在國(guó)外,PerezN等(2002)、PecorelliI等(2004)報(bào)道了液相色譜檢測(cè)滅菌奶以及肌肉組織中的SAs;KishidaK等(2004)報(bào)道了磺胺間甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶以及它們N4-乙?；x物的液相色譜檢測(cè)。HPLC也是我國(guó)規(guī)定的SAs的檢測(cè)方法,國(guó)內(nèi)也有不少相關(guān)研究:李蘭等(2003)研究了飼料中磺胺二甲基嘧啶及磺胺間甲氧嘧啶快速測(cè)定;崔艷莉等(2003)報(bào)道了豬血漿中的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異唑和甲氧芐胺嘧啶的測(cè)定。隨著近幾年國(guó)外對(duì)福建省出口的水產(chǎn)品中藥物殘留,特別是抗菌藥殘留的檢查越來(lái)越嚴(yán)格,為了能準(zhǔn)確地檢測(cè)出SAs殘留量,本文建立了用高效液相色譜檢測(cè)SMR、SDD、SMM、SDM和SQX的方法。2實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)試劑和試劑Agilent1200液相色譜儀(配有二極管陣列檢測(cè)器);離心機(jī)(上海安亭);旋渦混合器(上海精科);高速分散器(德國(guó)KIA);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生);分析天平(感量0.00001g);天平(感量O.0lg);數(shù)字可調(diào)移液器(法國(guó)吉爾森)。乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,提純用);二氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(廣東汕頭市西隴化工廠);正己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);磺胺甲基嘧啶(DrEhrenstorferGmbH公司);磺胺二甲基嘧啶(DrEhrenstorferGmbH公司);磺胺-6-甲氧嘧啶(DrEhrenstorferGmbH公司);磺胺二中氧嘧啶(DrEhrenstorferGmbH公司);磺胺喹惡啉(生產(chǎn)商DrEhrenstorferGmbH公司)。2.2色譜柱及檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:SupelcoDiscoveryC-18柱,250×4.6mm,粒徑5μm或同等效能的其他色譜柱;柱溫:35。C;流動(dòng)相:0.3%醋酸水溶液+乙腈=79+21;流速:1.0ml/min;二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng):265nm;進(jìn)樣量:50μl。2.3樣品制備取500g供試樣品,絞碎并使均勻,絞碎均勻的樣品置于-18℃以下冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.4分析步驟2.4..高效液相色譜法研究高效液相色譜分析稱取5.00±0.05g試樣置于50ml離心管A中,加入2ml水minishaker振搖1分鐘,加入20ml乙腈minishaker振搖1分鐘,4500rpm離心5分鐘,上清液移入裝有15ml二氯甲烷的50ml離心管B中,混合放氣后,4500rpm離心5分鐘,用一次性塑料吸管吸去上層水層,其余溶液移入雞心瓶,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃以下濃縮至干,用1ml20%乙腈水溶解殘留物,在旋渦混合器上振蕩90s,移入5ml離心管,加入2ml用乙腈飽和的正己烷凈化,4500rpm離心5分鐘,取下層樣液過(guò)0.20μm有機(jī)濾膜,供高效液相色譜分析。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加和回收2.4.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別移取0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml的SMR、SDD、SMM、SDM、SQX混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于2ml進(jìn)樣瓶中,高效液相色譜分析,制備濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.4.2.加標(biāo)回收試驗(yàn)分別移取0ml、0.250ml、0.50ml、1.00ml、2.50ml濃度為100ng/ml的SMR、SDD、SMM、SDM、SQX混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于含有5g陰性空白控制樣的50ml離心管中,混勻,按照2.3.1的步驟進(jìn)行提取凈化,樣液經(jīng)高效液相色譜分析,制備濃度-峰面積曲線,即加標(biāo)回收曲線。測(cè)定結(jié)果相當(dāng)于試樣中SMR、SDD、SMM、SDM、SQX的殘留量分別為0μg/kg,5μg/kg,10μg/kg,20μg/kg,50μg/kg;也相當(dāng)于樣液中SMR、SDD、SMM、SDM、SQX的殘留量分別為Ong/ml,25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,250ng/ml。3討論3.1氯甲烷與乙腈的混合溶液要現(xiàn)放氣振搖的時(shí)候要充分,對(duì)于較難打散的樣品振搖時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。二氯甲烷與乙腈的混合溶液要放氣,防止離心時(shí)離心管爆裂。在濃縮時(shí),要盡量避免出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象。旋渦混合要將雞心瓶?jī)?nèi)的附著物充分溶解下來(lái)。3.2smr、sdd、smm、sdm和sqx的分離五種SAs類物質(zhì)分離的色譜圖如圖2所示,結(jié)果表明,SMR、SDD、SMM、SDM、SQX這五類物質(zhì)能夠達(dá)到很好的分離效果。3.3smr、sdd、smm、sdm和sqx濃度峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線SMR、SDD、SMM、SDM、SQX的濃度一峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,能夠達(dá)到較好的線性,見(jiàn)表1。3.4smr、sdd、smm、sdm和sqx的附加曲線SMR、SDD、SMM、SDM、SQX的加標(biāo)濃度一峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,能夠達(dá)到較好的線性,見(jiàn)表2。4回收率、精密度水產(chǎn)品肌肉組織中SMR、SDD、SMM、SDM、SQX的檢測(cè)限為0.003mg/kg,測(cè)定低限為0.010mg/kg;工作曲線線性范圍0-0.250ug/mL;回收率范圍SMR69.9-91.1%、SDD74.5-98.9%、SMM63.1-88.5%、SDM66.0-