干眼模型的研究進展

干眼模型的研究進展

動物實驗是眼科學研究的重要手段。建立合適的眼睛模型是動物實驗的先決條件。目前已有多種建立干眼動物模型的方法,如通過營養(yǎng)因素、環(huán)境因素、毒性物質(zhì)、藥物作用、改變動物性激素分泌水平、去除淚腺或眼表的神經(jīng)支配、誘導(dǎo)淚腺產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)及手術(shù)摘除淚腺等。常用于制作干眼模型的動物主要有兔、狗及鼠等,此外也有貓、恒河猴、貂及馬等制作干眼模型的報道。本文綜述幾種主要的動物干眼模型的制作及特點。1干眼動物模型的制備兔眼球體積大,性格溫順,可直接觀察到熒光素染色、虎紅染色、Schiemer試驗等各項淚液學指標的變化,是常用的干眼動物模型之一。兔的淚腺非常發(fā)達,杯狀細胞密度高,加之有第三眼瞼(相當于一個軟性接觸鏡)的存在,增加了兔干眼模型制作的難度。此外,目前市場上用于抗兔的單克隆抗體極少,因此在干眼形成后要進一步進行有關(guān)的炎癥因子或細胞因子的檢查受到一定的限制。常用于制作干眼模型的兔為新西蘭大白兔,其制作方法主要有以下幾種。1.1淚液缺乏干眼模型1.1.1干眼的形成和模型的建立淚腺是淚液水液層的一個重要來源,哈氏腺有類似瞼板腺及皮脂腺的作用,第三眼瞼對眼表具有保護作用,因此摘除淚腺及哈氏腺,可致淚液分泌(主要是水液層)下降,并消除第三眼瞼對眼表的保護作用而產(chǎn)生淚液缺乏型干眼。Francois等證實了這一方法的可行性。但由于兔的杯狀細胞發(fā)達,加之此法沒有破壞副淚腺,因而干眼的形成往往需要兩個月甚至更長的時間,有時甚至不能形成明顯的干眼。如果淚腺沒有摘除干凈,則導(dǎo)致干眼模型制作失敗。此外,由于兔的淚腺分布范圍廣泛,手術(shù)損傷大,因而此模型早期淚膜的質(zhì)量受手術(shù)干擾較大。Gibard等對上述方法做了一定的改進。他不摘除淚腺,而是采用一種纖細的探針插入淚腺導(dǎo)管的開口對其進行灼烙,使得淚腺導(dǎo)管封閉,淚液不能排出。此法減少了手術(shù)對眼表的刺激與干擾,其效果與淚腺摘除相似,但尋找淚腺導(dǎo)管開口存在一定的困難。國內(nèi)謝漢平等在摘除淚腺、哈氏腺及第三眼瞼的基礎(chǔ)上,加用50%的三氯醋酸對結(jié)膜表面進行燒灼以破壞副淚腺及杯狀細胞,使得干眼更容易產(chǎn)生,且程度更為嚴重。但此法早期對眼表的干擾更大,如操作不當,可引起角膜潰瘍甚至穿孔。如果要進行有關(guān)促進杯狀細胞生長的藥物療效的觀察,使用的三氯醋酸濃度過高或燒灼的時間過長,有可能導(dǎo)致杯狀細胞徹底受損而觀察不到此類藥物的治療效果。也有單純摘除淚腺而不摘除哈氏腺及第三眼瞼制作淚液缺乏型干眼模型的報道,但其成功率更低。1.1.2阿托品滴眼藥物在兔干眼模型中的應(yīng)用淚腺受副交感神經(jīng)支配,副交感神經(jīng)的興奮可以引起淚液分泌增加,而副交感神經(jīng)受體阻斷劑則可導(dǎo)致淚液分泌的明顯下降。阿托品是一種常見的副交感神經(jīng)受體阻斷劑。Caruso等的研究發(fā)現(xiàn),肌內(nèi)注射阿托品(1.0mg/kg)可以產(chǎn)生兔干眼模型,但易產(chǎn)生全身副作用,使模型成功的幾率不高。Susi等制成1%的阿托品滴眼液局部滴眼可以很快產(chǎn)生熒光素染色、虎紅染色及Schiemer試驗下降等干眼體征,但作者僅觀察了6d。我們采用同樣的方法對此干眼模型進行35d的觀察,發(fā)現(xiàn)用藥后1周左右干眼體征最為明顯。隨著時間的延長,其干眼的表現(xiàn)呈逐漸減輕趨勢,說明這種干眼模型不能長時間維持在一個理想的狀態(tài)。而且整個實驗過程中,印跡細胞學檢查杯狀細胞密度均未出現(xiàn)明顯的下降,角膜、結(jié)膜及眼瞼病理切片檢查也未見異常,提示局部滴用阿托品滴眼液短期內(nèi)難以引起明顯的兔眼眼表上皮細胞的損害。因而這種干眼模型不適宜于長期實驗觀察的研究。1.1.3壓增大,杯狀細胞密度下降Gilbard利用射頻探針插入兔三叉神經(jīng)節(jié),去除兔眼表的神經(jīng)支配,發(fā)現(xiàn)淚液分泌量出現(xiàn)明顯下降,淚液滲透壓增高,杯狀細胞密度下降,表現(xiàn)出明顯的干眼改變。其原理可能為:淚腺、眼表成分和它們之間的神經(jīng)支配構(gòu)成一個完整的功能單位,其中任何一個環(huán)節(jié)受到損害,則用以維持正常眼表結(jié)構(gòu)的淚膜將受到影響。此方法的一個缺點是要準確定位到三叉神經(jīng)節(jié)具有一定的困難,此外,如果操作時溫度控制不當,有可能同時破壞三叉神經(jīng)中的運動支。1.1.4側(cè).側(cè)汗腺的免疫作用Guo等將兔一眼的淚腺摘除,用其自身淋巴細胞液培養(yǎng)5d后,將培養(yǎng)的淚腺淋巴混合細胞液注射至對側(cè)淚腺,以誘導(dǎo)對側(cè)淚腺組織產(chǎn)生自身免疫,從而產(chǎn)生類似Sj?gren綜合征的干眼模型。這種方法操作較為復(fù)雜,且雙側(cè)淚腺同時受損,不利于作自身對照。1.2過度蒸發(fā)的干眼模型1.2.1可逆性親水性干眼的聯(lián)合應(yīng)用瞼板腺分泌的脂質(zhì)是淚膜的最外層——脂質(zhì)層的主要來源。瞼板腺功能障礙可以導(dǎo)致淚膜脂質(zhì)層缺乏,使淚膜的破裂時間明顯縮短,淚液的蒸發(fā)率明顯增加,并引起淚液的滲透壓增加,造成眼表損害。此外,脂質(zhì)層異常還可以引起淚液清除障礙,使得淚液中的有毒物質(zhì)增加,最終導(dǎo)致干眼的發(fā)生。Gilbard等用纖細的電刀插入兔瞼板腺開口逐個進行灼烙(每個開口灼烙時間約1s),導(dǎo)致瞼板腺開口阻塞,瞼板腺脂質(zhì)不能正常排出,引起淚膜脂質(zhì)層異常,從而產(chǎn)生干眼。作者進行52周的觀察,發(fā)現(xiàn)此法成功率較高,許多兔在術(shù)后第6周左右出現(xiàn)明顯而穩(wěn)定的干眼表現(xiàn),而且技術(shù)要求低,需要的器械簡單。但因為需要將電刀逐個插入瞼板腺開口,因而操作費時。我們對Gilbard的方法進行改進:采用手術(shù)用燒灼器直接燒灼瞼板腺開口,使操作更簡便快速。我們發(fā)現(xiàn)采用此法在術(shù)后第4周左右就可出現(xiàn)明顯的虎紅染色及角膜熒光素染色等干眼體征。這可能與燒灼器溫度高,燒灼面大,使得瞼板腺破壞得更為徹底及局部炎癥反應(yīng)更為嚴重等因素有關(guān)。由于采用燒灼器直接燒灼瞼板腺開口對瞼板的損傷較大,早期(2周內(nèi))局部的炎癥反應(yīng)較重,因而對眼表上皮會產(chǎn)生一定的損害,對淚膜的穩(wěn)定性也有較大影響。上述兩種封閉瞼板腺開口制作干眼模型的方法雖然具有快速可靠的優(yōu)點,但可導(dǎo)致瞼板腺功能不可逆損害,與臨床上許多瞼板腺功能障礙干眼(通常為可逆)存在較大的差別,不適于觀察對瞼板腺功能有影響的藥物的療效。Jester等通過局部滴用腎上腺素建立了與臨床類似的可逆性瞼板腺功能障礙干眼模型。發(fā)現(xiàn)兔眼滴用腎上腺素后,瞼板腺導(dǎo)管可出現(xiàn)過度角化,造成導(dǎo)管開口狹窄或阻塞,瞼板腺分泌物排出障礙及分泌成分異常,從而產(chǎn)生瞼板腺功能障礙。此外,還有局部滴用異維甲酸或?qū)ρ鄄€局部采用放射線進行照射的方法,也可得到類似的結(jié)果。但制作瞼板腺功能障礙干眼模型往往需要很長的時間(約半年以上),而且成功率較低(有時成功率還不到40%)。1.2.2機械上提取的眼晶體產(chǎn)生了過度蒸發(fā)的干眼模型Fujihara發(fā)現(xiàn),機械性(開瞼器)上提兔眼瞼1~3h可快速產(chǎn)生干眼,但因干眼維持時間短,因而不適宜用于進行長期實驗觀察研究。1.3由于維生素a的缺乏給予維生素A缺乏飲食飼養(yǎng)新西蘭大白兔4~6個月,可以產(chǎn)生上皮性角膜結(jié)膜干燥模型。2鼠的腦膠囊模型鼠價格便宜,抗鼠的單克隆抗體定購十分容易,因此,在干眼研究中,鼠也是常用的實驗動物。由于鼠的眼球較小,有關(guān)淚液學的檢查不如兔方便,而且一些模型需要特殊的技術(shù)才能得到。常用的鼠干眼模型主要有以下幾種。2.1建立nfs/sld突變鼠干眼模型摘除鼠的淚腺可以產(chǎn)生淚液缺乏型干眼模型,但由于鼠眼體積小,手術(shù)操作具有一定的難度,同時應(yīng)注意手術(shù)對眼表的干擾。采用雜交技術(shù)得到的新西蘭黑/白(NZB/NZW)F1雜交鼠,隨著年齡的增長,其淚腺組織中可產(chǎn)生明顯的自身免疫反應(yīng),表現(xiàn)出類似Sj?gren綜合征的改變。通過基因突變技術(shù)得到的NFS/sld突變鼠,出生后3d摘除其胸腺,可得到原發(fā)性Sj?gren綜合征模型。Waterhouse等將鼠一側(cè)的淚腺摘除勻漿后,加入佐劑進行處理,然后回注入leiwns鼠的體內(nèi),可以誘導(dǎo)淚腺、唾液腺等自身免疫反應(yīng),產(chǎn)生類似Sj?gren綜合征的干眼模型。但由于回注的淚腺勻漿抗原性不高,因而成功率低(僅17%)。Sammy等對勻漿的淚腺組織加入百日咳桿菌進行進一步處理,可增強其抗原性,誘導(dǎo)更嚴重的淚腺、唾液腺自身免疫反應(yīng),使Sj?gren綜合征干眼模型的幾率明顯增高。此外,淚液缺乏型干眼模型還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因敲除的辦法,改變鼠的性激素分泌而獲得。藥物及環(huán)境是干眼形成的重要因素,在鼠干眼模型制造中,這些因素也得到充分的利用。Dursun等給SD鼠局部皮下注射東莨菪堿抑制鼠淚液的產(chǎn)生,同時將這些鼠放置在一鼓風裝置制造的干燥環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)可以較快地產(chǎn)生干眼模型。2.2治療嘴唇需要增加數(shù)據(jù)一些特殊類型的鼠本身就存在瞼板腺發(fā)育障礙的因素。Rhino鼠出生后不久,由于存在上皮變異及發(fā)育異常,瞼板腺導(dǎo)管上皮會出現(xiàn)增厚及過度角化,從而產(chǎn)生瞼板腺功能障礙。給鼠注射人單克隆抗DNA抗體,可以產(chǎn)生慢性瞼緣炎,并可使瞼板腺過度增生,瞼板腺中炎癥細胞浸潤,也可導(dǎo)致瞼板腺功能障礙產(chǎn)生。3抗炎藥物模型跟兔一樣,狗的眼球體積較大,容易觀察到干眼體征,因而是常用干眼動物之一。狗干眼模型的最大優(yōu)勢在于,正常狗的淚腺中即存在自身免疫性炎癥反應(yīng),