生殖毒性研究

第十八章生殖毒性研究1整理ppt第一節(jié)致畸胎研究研究概況年份

事件作者19321935194819501956196319661971維生素A缺乏可使猴胚胎畸形X射線照射使大鼠胚胎發(fā)生各種畸形氮芥導(dǎo)致大鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形反應(yīng)停（Thalidomide）事件美國藥物安全委員會美國FDA—人用藥生殖安全評價準(zhǔn)則WHO規(guī)定新藥應(yīng)有生殖毒性研究HaleGobHarriuBaxter2整理ppt先天愚型海豹肢畸形3整理ppt

生殖毒性研究（Reproductivetoxicitystudy）是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，它與急性毒性、長期毒性、遺傳毒性等毒理學(xué)研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進(jìn)入臨床研究及上市的重要環(huán)節(jié)。生殖毒性研究在限定臨床研究受試者范圍、降低臨床研究受試者和藥品上市后使用人群的用藥風(fēng)險方面發(fā)揮重要作用。4整理ppt生殖過程分期分期研究內(nèi)容檢測方法交配前到懷孕成年雄性/雌性動物的生殖功能；配子的發(fā)育和成熟；交配行為及生育力一般生殖毒性試驗懷孕到著床成年雄性/雌性動物的生殖功能；著床前的發(fā)育和著床著床到硬腭閉合成年雄性/雌性動物的生殖功能；胚胎發(fā)和大部分器官形成致畸試驗硬腭閉合到懷孕末期成年雌性動物的生殖功能；胚胎生長發(fā)育以及器官發(fā)育和生長出生到斷奶成年雌性動物的生殖功能；嬰兒在宮外生活的適應(yīng)性；斷奶前的發(fā)育和生長圍產(chǎn)期試驗斷奶到性成熟斷奶前的發(fā)育和生長；獨立生活的能力；完全達(dá)到性成熟避孕藥、性激素、性功能障礙藥、促精子生成藥、致突變試驗陽性或有毒作用的新藥，必須進(jìn)行生殖毒性試驗。5整理ppt第二節(jié)有關(guān)生殖毒性的基本概念

生殖是機(jī)體繁衍種族的生理過程，包括生殖細(xì)胞的發(fā)育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和發(fā)育、分娩和哺乳等過程。每一個環(huán)節(jié)均可能是化學(xué)物質(zhì)毒性作用的靶部位，機(jī)體接觸化學(xué)物質(zhì)后干擾了其生理過程，使生殖過程的功能出現(xiàn)缺陷和損害，此即化學(xué)物質(zhì)的生殖毒性。

生殖毒性有兩個特點：（1）對化學(xué)物質(zhì)的毒性作用敏感，一定劑量下，其他系統(tǒng)尚未出現(xiàn)損害之前，生殖過程中的某個環(huán)節(jié)或功能已經(jīng)出現(xiàn)障礙；（2）化學(xué)物質(zhì)毒性作用對其損害更為深遠(yuǎn)，不僅表現(xiàn)在接觸化學(xué)物的機(jī)體本身，還可影響后代。6整理ppt第二節(jié)有關(guān)生殖毒性的基本概念

畸胎學(xué)：從胚胎學(xué)和病理學(xué)發(fā)展出來的一個分支學(xué)科，是研究胚胎發(fā)育時期，由各種內(nèi)外因子引起結(jié)構(gòu)和功能異常的先天性畸形的科學(xué)。

致畸性（teratogenicity）：藥物接觸胚胎發(fā)生期后引起永久性結(jié)構(gòu)或功能異常的性質(zhì)。

胚胎毒性（embryotoxicity）：某些藥物在一定劑量僅對胚胎或胎兒有毒性作用而對母體沒有毒性作用，此作用被稱為胚胎毒性。胚胎毒性表現(xiàn)為胚胎死亡、胚胎生長遲緩、畸形和功能不全。

母體毒性（embryotoxicity

）：指藥物引起懷孕動物的毒效應(yīng)，如體重不增或減輕等，最嚴(yán)重的是死亡。7整理ppt第二節(jié)有關(guān)生殖毒性的基本概念

畸形（malformations）：永久性結(jié)構(gòu)異常或功能異常的胎兒和新生兒。通常不包括顯微鏡下細(xì)微結(jié)構(gòu)的異常,生化代謝性缺陷。單純功能異常(如精神缺陷、智力缺陷),也不包括分娩過程中各種因素造成的缺陷。

致畸指數(shù)（teratogenyindex）：為一種藥物對母體的半數(shù)致死量與最小致畸量的比值，是表示一種化學(xué)物質(zhì)的致畸強(qiáng)度指標(biāo)。建議致畸指數(shù)在10以下定為不致畸，10~100為致畸，100以上為強(qiáng)致畸。

出生缺陷(birthdefect)：指任何解剖學(xué)的和功能的異常。既包括形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常(大體的和細(xì)微的)，也包括功能、代謝、行為的異常。8整理ppt第三節(jié)一般生殖毒性試驗

[目的]

一般生殖毒性試驗（reproductivetoxicitytest）是研究藥物對整個生殖過程的影響。包括生殖細(xì)胞（精子、卵細(xì)胞）的發(fā)生，卵細(xì)胞受精、著床胚胎形成，胚胎發(fā)育階段的影響并作出評價。

[動物及分組]

至少一種動物，一般為大鼠或小鼠，每組雄性動物10只，雌性動物至少20只。9整理ppt第三節(jié)一般生殖毒性試驗

[給藥劑量及途徑]

給藥組設(shè)高、中、低三個劑量；高劑量應(yīng)能產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)，如體重增長緩慢等，但不應(yīng)出現(xiàn)嚴(yán)重中毒或死亡。給藥途徑應(yīng)盡量接近臨床。[給藥時間]

雄性動物交配前給藥60~80天，雌性動物交配連續(xù)給藥14天。交配后繼續(xù)給藥至大多數(shù)器官發(fā)生期（大鼠/小鼠為孕后13天）。10整理ppt第三節(jié)一般生殖毒性試驗

[檢查]雄性與雌性動物同籠交配后，每日檢查小鼠陰道中有無陰栓，大鼠則檢查精子，以檢查到陰栓或精子的當(dāng)日作為妊娠第0天。雌鼠于妊娠第13天解剖觀察，以確定妊娠、胎兒的吸收和死亡情況，并記錄母鼠的一般狀況、體重變化和胎盤重量，以確定子宮內(nèi)的活胎數(shù)，對活胎進(jìn)行性別鑒定、體重和身長的測量以及外表和內(nèi)臟器官的形態(tài)學(xué)觀察，對骨骼進(jìn)行茜紅素染色后進(jìn)行檢查，必要時進(jìn)行組織學(xué)和組織化學(xué)的詳細(xì)檢查。11整理ppt第三節(jié)一般生殖毒性試驗

[檢查]大鼠于孕期第20天處死（小鼠18天）。剖腹取出子宮及卵巢，辨認(rèn)和記錄活胎數(shù)，早死胎數(shù)、晚死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和黃體數(shù)，對活胎仔應(yīng)辨別性別、稱重，測量身長及尾長，仔細(xì)檢查活胎仔的外觀有無畸形，將每只母鼠的2/3活胎仔剝?nèi)テつw和內(nèi)臟，經(jīng)脫水透吸及茜紅素染色后，檢查骨骼畸形，將1/3活胎仔浸入Bouin氏溶液中固定，供檢查內(nèi)臟畸形。12整理ppt第三節(jié)一般生殖毒性試驗[結(jié)果判定]

×100%畸胎率%=畸胎總數(shù)活胎仔總數(shù)活胎仔平均畸形數(shù)=畸形總數(shù)活胎仔總數(shù)×100%母體畸胎出現(xiàn)率%=出現(xiàn)畸胎母體數(shù)妊娠母體總數(shù)*畸胎及畸形的計算方法13整理ppt第四節(jié)繁殖試驗

[目的、原理]

凡受試物能引起生殖機(jī)能障礙，干擾配子的形成或使生殖細(xì)胞受損，其結(jié)果除可影響受精卵或孕卵的著床而導(dǎo)致不孕外，尚可影響胚胎的發(fā)生及胎仔的發(fā)育，如胚胎死亡導(dǎo)致自然流產(chǎn)、胎仔發(fā)育遲緩以及胎仔畸形。如果對母體造成不良影響，出現(xiàn)妊娠、分娩和乳汁分泌的異常，亦可出現(xiàn)胎仔出生后發(fā)育異常。本試驗檢測藥物對整個生殖過程的毒性作用，通過繁殖試驗可以了解藥物對試驗動物的性腺功能、交配能力、受孕能力、妊娠過程、分娩、哺乳及對后代生長發(fā)育的影響。一般傾向于二代繁殖試驗。14整理ppt第四節(jié)繁殖試驗[動物及分組]

大鼠，至少設(shè)三個劑量級和一個對照組。每組動物應(yīng)至少能產(chǎn)仔20窩；F0代有生育能力的雄鼠至少10只，以后各代每組也應(yīng)至少有10只雄鼠。

[給藥劑量]

高、中、低三個劑量；高劑量應(yīng)有毒性作用，但不能引起10%以上動物死亡，且超過人體預(yù)期接觸水平。低劑量應(yīng)不產(chǎn)生可觀察到的有害作用。15整理ppt第四節(jié)繁殖試驗[方法]

以人體可能接觸的方式染毒。僅對F0及F1代動物染毒。

F0代動物自離乳起（6w之前）開始染毒，直到F1代離乳；F1代動物離乳（約30d）后，部分動物（用來繼續(xù)繁殖的動物）每天染毒，直到F2代離乳后30天。

F0代給藥至少100天后，開始交配，產(chǎn)生F1代。

F1代給藥至少數(shù)120天后，開始交配，產(chǎn)生F2代。16整理ppt第四節(jié)繁殖試驗17整理ppt第四節(jié)繁殖試驗[觀察指標(biāo)]

包括動物一般狀態(tài)、體重、進(jìn)食量及死亡情況；著重觀察受孕率、妊娠率、出生存活率、產(chǎn)仔總數(shù)及平均仔重等與生殖機(jī)能有關(guān)指標(biāo)。計算下述生殖指數(shù)：×100%1.生育力指數(shù)：受孕率%=妊娠雌鼠數(shù)交配雌鼠數(shù)×100%2.受孕指數(shù)：正常妊娠率%=活產(chǎn)雌鼠數(shù)妊娠雌鼠數(shù)×100%3.存活力指數(shù)：出生存活率%=生后4d存活仔數(shù)出生時活仔數(shù)×100%4.哺育指數(shù)：哺育存活率%=生后21d存活仔數(shù)出生后4d存活數(shù)18整理ppt第五節(jié)致畸試驗[原理]

母體在孕期受到可通過胎盤屏障的藥物作用,影響胚胎的器官發(fā)育,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和機(jī)能的缺陷,出現(xiàn)胎仔畸形。因此在受孕動物的胚胎著床后，并已開始進(jìn)入細(xì)胞及器官分化期時，可檢出該物質(zhì)對胎仔的致畸作用。致畸試驗（teratogenictest）為鑒定動物致畸物的標(biāo)準(zhǔn)方法。不僅能檢測到藥物的致畸性，也可得到有關(guān)藥物致胚胎死亡及生長遲緩的資料。19整理ppt第五節(jié)致畸試驗[動物]

要求選用對藥物敏感性高而自發(fā)畸形率低的動物，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用2種動物，一種為嚙齒類，另一種要求非嚙齒類（狗和猴）。[動物受孕及檢查方法]

未交配過的雌鼠，鼠齡3m以下，體重200-250g，做陰道分泌物涂片檢查，若發(fā)現(xiàn)白色分泌物較多，鏡下發(fā)現(xiàn)有核上皮細(xì)胞，則提示大鼠處于動情前期。此時，將其與雄鼠按2∶1或3∶2同籠過夜，次日檢查是否受孕。檢查是否受孕。（1）檢查陰栓：陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒。大鼠陰栓易脫落，小鼠陰栓不易脫落。（2）陰道涂片檢查精子。陰栓或精子檢出當(dāng)日記為孕0天，次日為孕第1天。

20整理ppt第五節(jié)致畸試驗[劑量分組]

分組

分高、中、低三個劑量組；陰性對照組；陽性對照組。

劑量確定

（1）高劑量應(yīng)有母體毒性反應(yīng)，或為最大給藥量；低劑量組應(yīng)為母體和胚胎毒性反應(yīng)劑量。（2）以LD50

的1/3~1/5為高劑量組；以LD50的1/30~1/100為低劑量。（3）以人實際接觸量做為低劑量組，并以其倍數(shù)（10倍）做為高劑量。

每組受孕動物數(shù)大鼠、小鼠15~20只；兔8~10只；狗和猴3~4只。21整理ppt第五節(jié)致畸試驗[給藥方式及時間]

給藥途徑根據(jù)藥物的性質(zhì)及人類可能的接觸方式定，多為灌胃和腹腔注射。給藥時間選在胚胎對致畸物的易感期（器官形成期）。22整理ppt第五節(jié)致畸試驗[觀察指標(biāo)]1每只實驗動物在試驗期間的受精日期、給藥日期和劑量、體重等基本指標(biāo)。

2對母體的觀察：每天檢查有無中毒癥狀，對有流產(chǎn)或早產(chǎn)征兆者（陰道出血）及時處死檢查。

3對胎仔的觀察A活仔外形的檢查B胎仔內(nèi)臟檢查C對胎仔骨骼檢查23整理ppt部位

畸形頭顱鼻眼耳腭頜和唇肢趾脊柱腹部尾肛門腦突出，露腦，顱脊柱裂，單純性腦膜膨出單鼻孔，鼻孔擴(kuò)張小眼，無眼，開眼，眼異位無耳，小耳，耳異位腭裂頜小，無頜，無口，唇裂短肢，畸形足多趾，少趾，缺趾，并趾脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱側(cè)凸臍疝短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，無尾肛門閉鎖常見畸形及部位（外觀畸形）24整理ppt部位

畸形顱頂骨枕骨頸椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨盤骨尾椎骨缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，錯位，骨化遲緩多肋，少肋，短肋，分叉肋，波狀肋，融合肋缺失，分裂，變形多骨，缺失缺失缺失，椎弓不連續(xù)，融合常見畸形及部位（骨骼畸形）25整理ppt部位

畸形頭腭口腔眼心血管肺膈腸肝腎生殖器膀胱腦積水，腦室擴(kuò)大腭裂短舌，分叉舌少眼，小眼，無眼右位心，室中隔缺損，單房室心，主動脈弓橫位氣管食管瘺，肺倒位，少葉橫膈缺損，并引起腹內(nèi)臟疝或內(nèi)臟側(cè)位腸疝肝異位，少葉馬蹄腎，腎積水，腎積水，腎缺失，腎異位子宮缺失，睪丸缺失或隱睪，睪丸發(fā)育不全（單側(cè)/雙側(cè)），兩性畸形缺失常見畸形及部位（內(nèi)臟畸形）26整理ppt第五節(jié)致畸試驗

[結(jié)果評定]

1對母體動物評定：

×100%×100%母體畸胎出現(xiàn)率（%）=妊娠母體數(shù)交配率%=已交配動物數(shù)實驗動物數(shù)死亡率%=死亡動物數(shù)實驗動物數(shù)出現(xiàn)畸形胎的母體數(shù)×100%母體增重=處死時母體體重–

妊娠第6日體重–處死時子宮連胎重27整理ppt第五節(jié)致畸試驗[結(jié)果評定]2對胎仔評定：×100吸收胎率（%）=早期吸收數(shù)+中期吸收數(shù)+晚期吸收數(shù)實驗動物數(shù)注意區(qū)分畸形數(shù)和畸胎數(shù)外觀畸形率%=外觀畸形數(shù)檢查胎仔數(shù)×1