長(zhǎng)白山野生斑玉孢生物學(xué)特性的研究

長(zhǎng)白山野生斑玉孢生物學(xué)特性的研究

由于棲息地破壞、污染、過(guò)度使用、外來(lái)物種入侵和疾病流行等原因，所有生物的生存都受到影響。為此,很多國(guó)家對(duì)本國(guó)的真菌(或某些類群)狀況進(jìn)行了不同程度的評(píng)估,有的已經(jīng)列出紅色名錄[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。而在我國(guó)除了冬蟲(chóng)夏草(Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora)、松茸(Tricholomamatsutake(S.Ito&S.Imai)Singer)等少數(shù)真菌以外,更多真菌的生存狀態(tài)幾乎未被關(guān)注,或者僅處于被認(rèn)識(shí)的初始階段。斑玉蕈為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈屬(Hypsizygus)真菌,分布于中國(guó)東北、云南等地;美國(guó)、加拿大和日本也有分布。斑玉蕈生于槭樹(shù)(Acerspp.)樹(shù)樹(shù)干(有損傷的部位)上,為優(yōu)良食藥兼用菌,已有人工栽培。但野生種群分布稀少,已被列入極危種。筆者通過(guò)對(duì)分布于長(zhǎng)白山的優(yōu)質(zhì)食用菌斑玉蕈(Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow)的生物學(xué)特性的研究,欲揭示該真菌的瀕危機(jī)理,以便推動(dòng)其他珍稀物種的保育研究。1材料和方法1.1菌種獲得和保存供試菌株:野生斑玉蕈子實(shí)體采自吉林省長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū),采用PDA培養(yǎng)基,組織分離法獲得菌種。菌種保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所。孢子印及孢子懸液:栽培子實(shí)體制作無(wú)菌孢子印,將剪刀滅菌后剪取部分孢子印置于無(wú)菌水中,并稀釋為適宜的孢子密度(400倍顯微鏡下每視野孢子數(shù)量20個(gè)左右)。1.2培養(yǎng)基用碳源利用試驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:基礎(chǔ)培養(yǎng)基為碳源(以2%葡萄糖的含碳量為標(biāo)準(zhǔn))+氮源(以0.2%蛋白胨的含氮量為標(biāo)準(zhǔn))+水。分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乙醇、麥芽糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)。分別用蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NaNO2、KNO3作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行氮源利用試驗(yàn)。將各處理的培養(yǎng)基分別加入100mL三角瓶?jī)?nèi),每瓶25mL,高壓滅菌、冷卻后,以直徑5mm打孔器定量接種。采用液體靜止培養(yǎng)的方法,于25℃黑暗條件下培養(yǎng),第15天稱量菌絲干質(zhì)量,比較不同的碳(或氮)源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響,每個(gè)處理3次重復(fù)。pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:用1.0mol/LHCl和1.0mol/LNaOH分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值至3、4、5、6、7、8、9、10、11。其他處理同碳源利用試驗(yàn)。溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:將培養(yǎng)料(棉籽殼5g+水6g)均勻裝入試管中,高壓滅菌、冷卻后接種。設(shè)5、10、15、20、25、30、35℃共7個(gè)梯度,黑暗條件下培養(yǎng),觀察不同溫度對(duì)菌種萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體原基發(fā)生的影響,從菌絲開(kāi)始吃料起(9d)每隔3d觀測(cè)菌絲生長(zhǎng)量,共測(cè)量6次,取平均值,根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)確定菌絲最適生長(zhǎng)溫度,每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)料含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:將棉籽殼5g分別加入不同體積的水,調(diào)含水量為45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%共7個(gè)梯度,均勻裝入試管中,高壓滅菌、冷卻后接種高粱菌種。于25℃黑暗條件下培養(yǎng),觀察不同含水量對(duì)菌種萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)的影響,從菌絲開(kāi)始吃料起(9d)每隔3d觀測(cè)菌絲生長(zhǎng)量,共測(cè)量6次,取平均值,根據(jù)菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)確定菌絲生長(zhǎng)的最適含水量,每個(gè)處理重復(fù)3次。孢子萌發(fā)條件:將斑玉蕈的新鮮孢子懸液接在蒸餾水和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中,觀察孢子萌發(fā)情況;將斑玉蕈的新鮮孢子懸液分別經(jīng)50、60、70、80℃熱處理10min后,接在蒸餾水和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中,觀察孢子萌發(fā)情況。子實(shí)體發(fā)生發(fā)育條件:采用袋栽法進(jìn)行子實(shí)體栽培試驗(yàn),每袋裝干料250g,經(jīng)高壓滅菌、冷卻后接高粱菌種。培養(yǎng)料配方為:棉籽殼98%、石灰粉1%、石膏粉1%,含水量65%。2結(jié)果與分析2.1氮源利用試驗(yàn)結(jié)果碳源利用試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明,斑玉蕈菌絲在供試碳源中均可以生長(zhǎng),方差分析結(jié)果表明其利用可溶性淀粉的效果最好,蔗糖次之,麥芽糖、乙醇、葡萄糖表現(xiàn)較差。因此推斷,斑玉蕈菌絲利用大分子糖的能力較強(qiáng),對(duì)單糖及醇類的利用能力較差。氮源利用試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,除了NaNO2,斑玉蕈菌絲在供試氮源中均可以生長(zhǎng),方差分析結(jié)果表明其利用蛋白胨的效果最好,(NH4)2SO4表現(xiàn)次之,其他2種差異不大。因此,斑玉蕈菌絲利用有機(jī)氮的能力最強(qiáng),利用銨態(tài)氮的能力次之,對(duì)硝酸鹽及尿素的利用效果最差。此外,NaNO2對(duì)斑玉蕈菌絲有明顯的毒害作用,菌種根本無(wú)法萌發(fā)。2.2ph值、溫度和接種量對(duì)斑玉蚤生長(zhǎng)的影響pH值試驗(yàn)結(jié)果表明,pH值為3時(shí),菌絲不能生長(zhǎng),pH=4～11時(shí)菌絲干質(zhì)量分別為:0.0148、0.0230、0.0188、0.0154、0.0142、0.0127、0.0058、0.0040g?？梢?jiàn),菌絲生長(zhǎng)的pH值范圍比較廣泛,但更適于偏酸性環(huán)境,最適pH值為5。溫度試驗(yàn)結(jié)果表明,斑玉蕈菌絲在10、15、20、25、30℃條件下的生長(zhǎng)速率分別為:0.083、0.187、0.207、0.234、0.160cm/d?？梢?jiàn),25℃為菌絲生長(zhǎng)的最適溫度。培養(yǎng)料含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的結(jié)果(表3)表明:菌絲在培養(yǎng)料含水量為45%～70%時(shí)均可以生長(zhǎng),但綜合考慮菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲長(zhǎng)勢(shì),60%～65%為菌絲生長(zhǎng)的最佳含水量。當(dāng)培養(yǎng)料含水量達(dá)到75%時(shí),菌絲無(wú)法生長(zhǎng)。2.3熱處理培養(yǎng)過(guò)程中全保健酸發(fā)酵劑的萌發(fā)斑玉蕈的新鮮孢子在蒸餾水、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中未見(jiàn)萌發(fā),分別經(jīng)50、60、70、80℃熱處理10min后接于蒸餾水、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基上仍未見(jiàn)萌發(fā)。其孢子萌發(fā)有可能需要一定時(shí)間的后熟或其他特殊環(huán)境條件的刺激。2.4子實(shí)體原基co/o2發(fā)育的影響在所有的溫度處理中,只有恒溫20℃的處理有子實(shí)體原基產(chǎn)生,將所有溫度處理的材料統(tǒng)一置于18～22℃的黑暗環(huán)境條件下,15d后陸續(xù)產(chǎn)生原基。這說(shuō)明斑玉蕈子實(shí)體原基發(fā)生的溫度范圍為20℃左右。但原基發(fā)育對(duì)濕度要求較高,原基很容易在濕度較小的環(huán)境中枯萎,喪失活力。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在栽培的菌袋面對(duì)窗口的一面子實(shí)體原基發(fā)生數(shù)量明顯多于背向窗口的一面。說(shuō)明光線雖然不是子實(shí)體原基發(fā)生的必要條件,但是一定強(qiáng)度的散射光可以增加原基發(fā)生的數(shù)量。另外,觀察發(fā)現(xiàn)斑玉蕈子實(shí)體的發(fā)育也有明顯的向光性。CO2/O2對(duì)子實(shí)體原基發(fā)育的影響與冬菇(Flammulinavelutipes(Curtis)Singer)等食用菌相似。斑玉蕈子實(shí)體原基的正常發(fā)育需要一定體積分?jǐn)?shù)的O2,如果CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌柄徒長(zhǎng)而菌蓋不分化。因此,子實(shí)體原基要順利的發(fā)育為正常的子實(shí)體需要一個(gè)通氣良好的環(huán)境。斑玉蕈孢子彈射量與子實(shí)體成熟程度關(guān)系密切,開(kāi)傘之后一直到菌蓋邊緣完全平展之前需要5～7d,這段時(shí)間孢子彈射量很小,菌蓋邊緣完全平展后孢子彈射量會(huì)突然增加。3斑玉蚤的人工誘導(dǎo)與生長(zhǎng)菌絲營(yíng)養(yǎng)特性研究表明,斑玉蕈菌絲利用大分子糖的能力較強(qiáng),而對(duì)小分子的單糖利用率較低;利用有機(jī)氮的能力最強(qiáng),利用銨態(tài)氮的能力次之,對(duì)硝酸鹽及尿素的利用效果最差。對(duì)菌絲生長(zhǎng)的環(huán)境條件研究表明,斑玉蕈菌絲生長(zhǎng)的最適溫度是25℃,最適pH值為5,最適培養(yǎng)料含水量為65%。在斑玉蕈菌絲生物學(xué)特性方面,未發(fā)現(xiàn)明顯制約其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的因素。斑玉蕈對(duì)基物選擇范圍決定了其所能占有的資源的多少。斑玉蕈生于槭樹(shù)樹(shù)干(有損傷的部位),而且多生于枯立木上,其所能夠利用的資源十分有限,這對(duì)其種群的健康發(fā)展是一個(gè)比較大的障礙。斑玉蕈在常規(guī)條件下及高溫刺激下仍無(wú)法萌發(fā),可能是由于其孢子的休眠,也可能是由于其孢子萌發(fā)需要更加特殊而苛刻的環(huán)境條件所致?？傊?其孢子難以在常規(guī)條件下萌發(fā)是其種群稀少的可能因素之一。斑玉蕈原基發(fā)生數(shù)量較多,但原基發(fā)育對(duì)濕度要求較高,原基很容易在濕度較小的環(huán)境中枯萎,喪失活力。從子實(shí)體原基發(fā)生到子實(shí)體完全成熟需要7～10d,這期間一直需要較高的濕度環(huán)境才能確保子實(shí)體成熟并大量彈射孢子。因此,其大量彈射孢子對(duì)高濕度環(huán)境的長(zhǎng)時(shí)間依賴性是其生活史各環(huán)節(jié)相互銜接的一個(gè)重要的制約因素。此外,野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)斑玉蕈子實(shí)體多發(fā)生于保存完好的原始天然林,而人工林和次生林中尚未發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)70年代以來(lái)大規(guī)模的森林采伐使得原始天然林的面積銳減。目前,斑玉蕈在中國(guó)東北只有長(zhǎng)白山區(qū)和大、小興安嶺有分布。以上幾方面的原因?qū)е掳哂褶σ吧N群分布狹小且數(shù)量稀少,甚至處于極危狀態(tài)。因此,應(yīng)在進(jìn)一步加強(qiáng)其生態(tài)調(diào)查研究的同時(shí)主要保護(hù)斑玉蕈的生存環(huán)境以及其生長(zhǎng)的基物,為其種群的恢復(fù)提供基本的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)其確切已知的分布點(diǎn)做定位研究,對(duì)分布點(diǎn)及附近區(qū)域的生態(tài)環(huán)境進(jìn)行整體保護(hù)。目前,斑玉蕈人工栽培技術(shù)已經(jīng)趨于成熟,長(zhǎng)白山斑玉蕈在吉林長(zhǎng)春和新疆阿拉爾地區(qū)均獲得大