新高考生物通用版總復習一輪課件選修3專題14基因工程生物技術的安全性和倫理問題

選修3現(xiàn)代生物科技專題[思維網(wǎng)絡]專題1、4基因工程、生物技術的安全性和倫理問題[考情分析]

考點一1.限制性核酸內切酶DNA重組技術的基本工具

[考點梳理]

(1)來源：多數(shù)來自____________。

(2)作用特點。 ①主要切割外源DNA，而對自身的DNA不起作用，達到保護自身的目的。 ②專一性：只能識別DNA分子中特定的核苷酸序列，且只能在每一條鏈中特定的部位進行切割。原核生物

(3)識別序列的特點：限制酶識別的序列大多數(shù)為________結構，切割位點在DNA兩條鏈相對稱的位置。(4)作用結果——黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在它識別序列的中軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時形成的(錯位切)，如下圖所示：回文對稱②平末端：是限制酶在識別序列的中軸線切開時形成的(平切)，如下圖所示：磷酸二酯鍵

(5)作用實質：使特定部位的兩個核苷酸之間的__________斷開。限制酶選擇的注意事項(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類。①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。

③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoR

Ⅰ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。(2)根據(jù)質粒的特點確定限制酶的種類。①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。

②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復制。2.DNA連接酶拼接成新的(1)作用：將限制酶切割下來的DNA片段_____________________________。大腸桿菌黏性末端(2)類型。黏性末端和平末端磷酸二酯鍵DNA分子(3)DNA連接酶和限制酶的關系。3.載體(1)條件。攜帶外源DNA片段進入受體細胞[易錯診斷]1.DNA連接酶能將兩堿基間通過氫鍵連接起來。()答案：×2.E·coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。((

)答案：×3.每個質粒DNA分子上至少含一個限制酶切割位點。

)答案：√4.質粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體。(

)答案：√5.切割質粒的限制性核酸內切酶均能特異性地識別6個核)苷酸序列。(

答案：×[基礎測評]1.下列屬于“分子縫合針”的是()③DNA聚合酶②DNA連接酶

B.①② D.②④

①E.coilDNA連接酶④解旋酶 ⑤RNA聚合酶

A.①②③ C.①②⑤

答案：B2.用基因工程技術可使大腸桿菌合成人的蛋白質。下列敘述不正確的是()

A.常用相同的限制性內切酶處理目的基因和質粒

B.DNA連接酶和RNA聚合酶是構建重組質粒必需的工具酶

C.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質粒

D.導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達

答案：B

考點二1.基因工程的概念基因工程的基本操作程序

[考點梳理]基因重組(1)供體：提供__________。(2)操作環(huán)境：______。(3)操作水平：________水平。(4)原理：___________。(5)受體：表達目的基因。受體(6)本質：性狀在______體內的表達。目的基因體外分子

(7)優(yōu)點：克服_________________的障礙，定向改造生物的遺傳性狀。

(8)基本操作程序。遠緣雜交不親和

2.目的基因的獲取

(1)目的基因：主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是具有調控作用的因子。

(2)獲取方法。 說明：基因文庫相當于某種生物的基因倉庫，儲存著大量該物種的基因。②人工合成3.基因表達載體的構建——重組質粒的構建(1)構建基因表達載體的目的。①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。(2)構建步驟。(3)基因表達載體的組成。4.將目的基因導入受體細胞的方法農(nóng)桿菌轉化顯微注射感受態(tài)細胞5.目的基因的檢測與鑒定

[易錯診斷]1.為培育抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體。()答案：×2.抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體DNA上也未必能正常表達。()答案：√3.檢測目的基因是否成功表達可用抗原—抗體雜交技術。(

)答案：√

[基礎測評] 1.某蔬菜地栽種了一種抗蟲大白菜，是運用轉基因技術把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因DXT轉移到大白菜細胞中培育而成的，在這一過程中要進行基因表達載體的構建。根據(jù)所學知識推斷，作為重組載體應具備的結構有()A.目的基因、啟動子B.目的基因、終止子C.目的基因、啟動子、終止子D.目的基因、啟動子、終止子、標記基因答案：D2.下圖為基因表達載體的模式圖，若結構a是基因表達載)體所必需的，則a最可能是( A.氨芐青霉素抗性基因

B.啟動子

C.限制酶

D.DNA連接酶

答案：B3.從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定目的基因的方法有()②PCR擴增技術擴增①從基因文庫中獲取目的基因③人工合成基因④RNA復制B.①②③④D.①②③A.①②④C.②③④答案：D考點三基因工程的應用、生物技術的安全性及蛋白質工程

[考點梳理]1.基因工程的應用(1)基因工程的應用舉例。(2)基因工程藥物。①來源：主要來自轉基因的工程菌，也可來自各類生物反應器。②成果：細胞因子、抗體、疫苗、激素等。③作用：預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕等疾病。(3)比較基因治療與基因診斷。正?；驂A基互補DNA探針配對2.生物技術的安全性和倫理問題(1)轉基因生物的優(yōu)缺點。(2)試管嬰兒與克隆人。①試管嬰兒和設計試管嬰兒的比較。

a.不同點：設計試管嬰兒在胚胎移植前需進行遺傳學診斷或基因診斷，試管嬰兒不需進行遺傳學診斷或基因診斷。圖中①②③是試管嬰兒的培育過程，①②④⑤是設計試管嬰兒的培育過程。

應用：試管嬰兒主要是解決不孕不育夫婦的生育問題，設計試管嬰兒主要用于白血病、貧血癥等疾病的治療。

b.相同點：都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養(yǎng)，都要經(jīng)過胚胎移植，都屬于有性生殖。 ②治療性克隆和生殖性克隆的比較。(3)生物武器的特點及傳播途徑。①特點：傳染性強；污染面廣，危害時間長；難以防治；具有一定的潛伏期；受自然條件影響大。②傳播途徑：經(jīng)食物和水傳播；空氣傳播；接觸傳播；蟲媒傳播；病原體直接傳播。3.蛋白質工程結構規(guī)律生物功能(1)概念。①基礎：蛋白質分子的_________及其與_________的關系。②手段：通過_________或_________，對現(xiàn)有蛋白質進行_________?；蛐揎椈蚝铣苫蚋脑?2)蛋白質工程流程圖。(3)結果：改造了現(xiàn)有蛋白質或制造出____________。(4)應用：主要集中應用于對____________進行改造，改良生物性狀。新的蛋白質現(xiàn)有蛋白質(5)基因工程和蛋白質工程的比較。(續(xù)表)(續(xù)表)

[易錯診斷]1.蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操)作，定向改變分子的結構。(

答案：×2.基因工程只能產(chǎn)生自然界已存在的蛋白質。()答案：√3.動物基因工程的實施主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質，不)一定是為了產(chǎn)生體型巨大的個體。(

答案：√4.由大腸桿菌工程菌獲得人的干擾素后可直接應用。()

答案：×

5.利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因導入了動物)的乳腺細胞中。(

答案：×[基礎測評]1.蛋白質工程的基本途徑是()①預期蛋白質功能②推測應有的氨基酸序列③表達(轉錄和翻譯)④形成預期功能的蛋白質⑤合成相對應的脫⑥設計預期的蛋白質結構

B.⑤③②⑥④① D.⑥①②⑤③④氧核苷酸序列(基因) A.①②③⑤⑥④ C.①⑥②⑤③④

答案：C2.科學家已能運用基因工程技術，讓羊的乳腺合成并分泌人體某些種類的抗體，以下敘述不正確的是()A.該技術可導致定向變異B.表達載體中需要加入乳腺蛋白的特異性啟動子C.目的基因是抗原合成基因D.受精卵是理想的受體細胞答案：C3.基因工程與蛋白質工程的區(qū)別是()

A.基因工程需對基因進行分子水平操作，蛋白質工程不需對基因進行操作

B.基因工程合成的是天然存在的蛋白質，蛋白質工程可以合成自然界不存在的蛋白質

C.基因工程是分子水平操作，蛋白質工程是細胞水平(或性狀水平)操作

D.基因工程與蛋白質工程完全不同

答案：B考向1限制性核酸內切酶

[典例1](2019年新課標Ⅰ卷)基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。

(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀╛___________和____________。

(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是____________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的____________。

(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________________________________。

[解析](1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀ɑ蚪M文庫和cDNA文庫。(2)生物體細胞內的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是解旋酶。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是加熱至90～95℃。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的氫鍵。(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活。[答案](1)基因組文庫cDNA文庫(2)解旋酶加熱至90～95℃氫鍵

(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活與DNA技術有關的酶的比較(續(xù)表)(續(xù)表)(1)DNA連接酶連接兩個DNA片段，而DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸添加到脫氧核苷酸鏈上。

(2)限制性核酸內切酶的作用是識別、切割某種特定的脫氧核苷酸序列，使兩條鏈在特定的位置斷開，而解旋酶是將連接DNA的兩條鏈的氫鍵打開形成單鏈。(3)基因工程中目的基因的獲取和質粒的切割都由相同的限制性核酸內切酶切割。

(4)DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶分別以DNA單鏈或RNA單鏈為模板，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶不需要模板。(5)上述酶的化學本質都是蛋白質。

[考向預測] 1.(2019年江蘇徐州模擬)已知限制性內切酶Xma

Ⅰ和SmaⅠ的識別序列分別為—C↓CCGGG—和—CCC↓GGG—。有關這兩種酶及應用的敘述，錯誤的是()A.這兩種酶作用的底物都是雙鏈DNAB.DNA中出現(xiàn)這兩種酶識別序列的概率不同C.XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD.使用這兩種酶時需注意控制反應溫度、時間等

解析：限制酶作用的底物是雙鏈DNA

分子，A正確；這兩種限制酶識別的序列相同，故DNA中這兩種酶識別序列出現(xiàn)的概率相同，B錯誤；根據(jù)堿基互補配對原則，CCCGGG的互補鏈是GGGCCC，并根據(jù)XmaⅠ的切割位點可知，切割后的黏性末端是—GGCC，C正確；溫度能影響酶的活性，所以使用酶時需要注意控制反應溫度和時間等，D正確。答案：B

2.將某病毒的外殼蛋白(L1)基因與綠色熒光蛋白(GFP)基因連接，構建L1—GFP融合基因，再將融合基因與質粒連接構建下圖所示表達載體。圖中限制酶E1至E4處理產(chǎn)生的黏性末端均不相同。下列敘述不正確的是()

A.構建L1—GFP融合基因需要用到E1、E2、E4三種酶 、E4雙酶切確保L1—GFP融合基因與載體的正確連接

C.GFP可用于檢測受體細胞中目的基因是否表達

D.將表達載體轉入乳腺細胞，可培育乳汁中含L1蛋白的轉基因羊

解析：構建L1—GFP融合基因需要先用內切酶處理獲得L1基因和GFP基因，并將二者連接，故需要用到E1、E2、E4三種酶，A正確；圖中限制酶E1至E4處理產(chǎn)生的黏性末端均不相同，E1、E4雙酶切可以有效減少載體自身連接和融合基因自身連接，保證L1—GFP融合基因與載體準確連接，B正確；綠色熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達，C正確；為了獲得L1蛋白，可將表達載體轉入受精卵中而不是乳腺細胞，用于培育乳汁中含有L1蛋白的轉基因羊，D錯誤。答案：D考向2基因工程的原理及工具

[典例2](2018年海南卷)甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質。為了改善黃瓜的品質，科學家采用農(nóng)桿菌轉化法將一種甜蛋白基因成功導入黃瓜細胞，得到了轉基因植株?；卮鹣铝袉栴}：

(1)用農(nóng)桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜________(填“受傷的”或“完好的”)葉片與含重組質粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，選用這種葉片的理由是______________________________________。

(2)若在轉基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質粒中______________已轉移到植物細胞中且能夠表達；用該轉基因黃瓜的某一植株與一株非轉基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個體數(shù)與不含甜蛋白個體數(shù)之比為1∶1，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到____________(填“核基因組”“線粒體基因組”或“葉綠體基因組”)中。

(3)假設某種轉基因作物因為受到病毒感染而減產(chǎn)，若要以該轉基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用________作為外植體進行組織培養(yǎng)。

(4)通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為______________________________________________________________。

[解析](1)用農(nóng)桿菌感染時，應優(yōu)先選用黃瓜受傷的葉片與含重組質粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，理由是葉片傷口處的細胞會釋放出大量酚類物質，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞。(2)若在轉基因黃瓜中檢測到這種甜蛋白，則表明該重組質粒中甜蛋白基因已轉移到植物細胞中且能夠表達；用該轉基因黃瓜的某一植株與一株非轉基因植株雜交，發(fā)現(xiàn)子代中含甜蛋白個體數(shù)與不含甜蛋白個體數(shù)之比為1∶1，則說明甜蛋白基因已經(jīng)整合到核基因組中。(3)假設某種轉基因作物因為受到病毒感染而減產(chǎn)，若要以該轉基因作物為材料獲得脫毒苗，應選用莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)。(4)通常，基因工程操作主要有4個步驟，即目的基因獲取、重組表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。因此，基因工程的含義可概括為按照人們的愿望進行設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型。[答案](1)受傷的葉片傷口處的細胞釋放出大量酚類物質，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞(2)甜蛋白基因核基因組

(3)莖尖

(4)按照人們的愿望進行設計，并通過體外重組和轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出符合人們需要的新生物類型[考向預測]

3.(2019年天津濱海七校高三聯(lián)考)基因工程中，GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產(chǎn)物，GFP基因會產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這兩種基因都可作為標記基因來研究發(fā)育生物學的問題。利用雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)和Cre/loxP重組酶系統(tǒng)技術可更好地實現(xiàn)該研究。請據(jù)圖作答：圖1圖2

(1)圖1為雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖。該系統(tǒng)能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點，圖中行使這些功能的分子結構分別是____________、____________。圖中向導RNA與DNA結合的原理是____________。將刪除區(qū)切割后，轉入基因與原DNA片段可通過形成____________拼接起來，形成新的DNA序列。

(2)雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可直接在靶細胞內起作用，與傳統(tǒng)的基因工程相比，該操作無需__________(填寫工具)。與質粒載體導入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的基因可以不含____________________________________________。

(3)圖2為Cre/loxP重組酶系統(tǒng)作用示意圖。利用雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可精準地將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35s啟動子之后可在組織中檢測出藍色而無綠色熒光區(qū)，這是由于__________基因自身無啟動子而無法表達。Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達，在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區(qū)，據(jù)此分析綠色熒光區(qū)形成的原因是_____________________________________________________，采用__________________等手段可以擴大組織中綠色熒光區(qū)的面積。

解析：(1)圖1為雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用示意圖。該系統(tǒng)能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點的原因分別是向導RNA能識別特定序列、Cas9蛋白能定點切割DNA序列。圖中向導RNA與DNA結合的原理是堿基互補配對。將刪除區(qū)切割后，轉入基因與原DNA片段可通過形成磷酸二酯鍵拼接起來，形成新的DNA序列。(2)雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)可直接在靶細胞內起作用，與傳統(tǒng)的基因工程相比，該操作無需載體(運載體)。與質粒載體導入外源基因相比，雙CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯的基因可以不含啟動子、終止子和標記基因。(3)GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產(chǎn)物，GFP基因會產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在組織中檢測出藍色而無綠色熒光區(qū)，說明GUS基因正常表達而GFP基因不能正常表達，根據(jù)“Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達，在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區(qū)”提示，可見GFP基因的正常表達需以Cre基因被激活表達為前提，即GFP基因自身無啟動子，無法啟動自身的表達。通過用Cre重組酶處理后，切割loxP序列，產(chǎn)生GFP基因的啟動子，使GFP基因得以表達。由于Cre基因是重組酶基因，經(jīng)38℃熱處理后可被激活表達，因此熱處理時間越長，越有利于基因的表達，綠色熒光區(qū)的面積就越大。答案：(1)向導RNACas9蛋白堿基互補配對磷酸二酯鍵(2)載體(運載體、質粒)啟動子、終止子和標記基因(3)GFP重組酶能(特異性識別并)切割loxP序列，使GFP基因得以表達延長熱處理時間考向3基因工程的基本操作程序

[典例3](2018年新課標Ⅰ卷)回答下列問題：

(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達。該研究除證明了質粒可以作為載體外，還證明了___________________________________________________________(答出兩點即可)。

入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_______組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞。在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是______________________。(2)體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋參與的___________方法導

(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解。為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用__________的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加__________的抑制劑。

[解析](1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該過程證明了體外重組的質?？梢赃M入受體細胞，真核生物基因可在原核細胞中表達等。(2)體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋處理，目的是以增大細胞的通透性，使重組的質粒能夠導入到受體細胞內，因此體外重組的質?？赏ㄟ^Ca2＋參與的轉化方法導入大腸桿菌細胞。體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質外殼組裝成完整的噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組噬菌體DNA導入受體細胞。噬菌體侵染的是細菌，而不能寄生在其他細胞中，因此可作為重組噬菌體宿主細胞的是細菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細胞內表達時，表達出的蛋白質可能會被降解，為防止蛋白質被降解，可以選用不能產(chǎn)生該蛋白酶的缺陷細菌以及使用能夠抑制蛋白酶活性的藥物，因此為防止蛋白質被降解，在實驗中應選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。

[答案](1)體外重組的質?？梢赃M入受體細胞，真核生物基因可在原核細胞中表達(2)轉化外殼蛋白(或噬菌體蛋白)細菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶[考向預測]

4.(2019年江蘇卷)圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。請回答下列問題：圖1圖2(1)EcoRV酶切位點為…GAT↓ATC……CTA↑TAG…，EcoRV酶切出來的線性載體P1為______末端。

(2)用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個堿基為________的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重組質粒P3。

(3)為篩選出含有重組質粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板進行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長情況如下表(“＋”代表生長，“－”代表不生長)。根據(jù)表中結果判斷，應選擇的菌落是________(填表中字母)類，另外兩類菌落質粒導入情況分別是________、________。

(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段，原因是___________________________。解析：(1)根據(jù)題意分析，EcoRV

酶識別的序列是－GATATC－，并且兩條鏈都在中間的T與A之間進行切割，因此其切出來的線性載體P1為平末端。(2)據(jù)圖分析，目的基因兩側為黏性末端，且漏出的堿基為A，則在載體P1的兩端需要加一個堿基T

形成具有黏性末端的載體P2，再用DNA連接酶將P2與目的基因連接起來形成重組質粒P3。(3)根據(jù)以上分析可知，限制酶切割后破壞了四環(huán)素抗性基因，但是沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此含有重組質粒P3的菌落在四環(huán)素中應該不能生長，而在氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能生長，結合表格分析可知，應該選擇B類菌落。根據(jù)表格分析，A類菌落在氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中都能夠生長，說明其導入的是P0；C類菌落在任何抗生素的培養(yǎng)基中都不能生長，說明其沒有導入任何質粒。(4)據(jù)圖分析，根據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術的原理分析，PCR鑒定時應該選擇的一對引物是乙和丙；根據(jù)題意和圖形分析，某同學用圖中的另外一對引物(甲、乙)從某一菌落的質粒中擴增出了400bp的片段，說明其目的基因發(fā)生了反向連接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA連接(3)BA類菌落含有P0C類菌落未轉入質粒(4)乙、丙目的基因反向連接考向4基因工程的應用

[典例4](2018年新課標Ⅱ卷)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達，某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同?；卮鹣铝袉栴}：

(1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是____________，使用這兩種酶進行酶切是為了保證____________，也是為了保證________________。

(2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了__________和____________過程。

(3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的__________移入牛的________中，體外培養(yǎng)，胚胎移植等。

(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定，在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的__________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。

[解析](1)要保證目的基因在受體細胞中能夠正確表達，目的基因的首端應有啟動子，尾端應有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切既保證了甲的完整，也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶是E1和E4。(2)構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產(chǎn)物在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達?；虻谋磉_包括轉錄和翻譯。(3)若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。[答案]

(1)E1和E4甲的完整甲與載體正確連接(2)轉錄翻譯(3)細胞核

去核卵母細胞(4)核DNA基因工程操作過程中的四個注意點

(1)限制酶剪切目的基因與質粒的次數(shù)不同：獲取一個目的基因需限制酶剪切2次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端，切割質粒則只需限制酶剪切1次，因為質粒是環(huán)狀DNA分子，而目的基因在DNA分子鏈上。

(2)切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶：如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。

(3)目的基因的插入點不是隨意的：基因表達需要啟動子與終止子的調控，所以目的基因應插入到啟動子與終止子之間的部位。

(4)基因工程操作過程中只有第三步?jīng)]有堿基互補配對現(xiàn)象：第一步存在于用逆轉錄法等獲得DNA

時，第二步存在于黏性末端連接時，第四步存在于分子水平雜交檢測時。

[考向預測] 5.B基因存在于水稻基因組中，僅在體細胞和精子中正常表達，在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響，設計并完成了如下實驗來獲取能夠在卵細胞中表達B基因的轉基因植株。下列關于該實驗的敘述，錯誤的是()

注：啟動子*指可在水稻卵細胞中啟動轉錄的啟動子；Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產(chǎn)生熒光。A.B基因在水稻卵細胞中不轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄B.可利用水稻體細胞和精子中的RNA構建cDNA文庫，從中獲得B基因中編碼蛋白的序列C.過程②在培養(yǎng)基中應加入卡那霉素以檢測T-DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上D.在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發(fā)出熒光

解析：啟動子是與RNA

聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵細胞中不能轉錄，可能是B基因的啟動子在卵細胞中無法啟動轉錄，A正確；目的基因獲取途徑之一就是從cDNA文庫中獲得，B正確；檢測T-DNA是否整合到水稻細胞染色體DNA上，應該用DNA分子雜交法，C錯誤；由于基因表達載體上有Luc基因，其表達的熒光素酶能催化熒光素產(chǎn)生熒光，所以在鑒定和篩選轉基因植株時，可以檢測加入熒光素的該植株卵細胞中是否發(fā)出熒光，D正確。答案：C

6.(2019年四川成都模擬)圖1所示為用PvuⅠ限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段的示意圖；圖2所示為三種質粒結構，含復制原點標記基因(圖中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因)、EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶切割位點等。請回答下列相關問題：圖1圖2(1)組成片段D的基本骨架與細胞膜的基本骨架相同的元素是____________。

(2)圖2中質粒A、質粒C能否作為目的基因運載體最理想的質粒？________(填“能”或“否”)，請說明理由______________________________________________________________。(3)重組質粒成功導入受體細胞的概率一般僅為10－7，用質－粒B構建重組質粒后，為了篩選出導入了重組質粒的大腸桿菌，在導入完成后，將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基的生長狀況不可能的是_________________________________________________，最可能是_____________________________________________。

(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達產(chǎn)物，則需要將重組質粒導入至山羊的________(細胞種類)中。

解析：(1)脫氧核糖和磷酸交替連接構成DNA片段D的基本骨架，脫氧核糖由C、H、O三種元素組成，組成磷酸的元素是H、P、O；磷脂雙分子層構成細胞膜的基本骨架，磷脂分子是由C、H、O、N、P組成，可見組成片段D的基本骨架與細胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析圖2可知：質粒A缺少標記基因，質粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復制原點會被限制酶切割，進而影響重組質粒的自主復制，所以質粒A、質粒C均不能作為目的基因運載體最理想的質粒。(3)用質粒B構建重組質粒，當用和目的基因相同的限制酶(PvuⅠ)切割時，Tc遭到破壞，而Ap結構完好，因此在重組質粒導入完成后，將所有大腸桿菌分別在含有四環(huán)素和氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，大腸桿菌在兩種培養(yǎng)基的生長狀況不可能的是在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長。因重組質粒成功導入受體細胞的概率一般僅為10－7，所以最可能是在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長。(4)若想在山羊的乳汁中收獲上述目的基因的表達產(chǎn)物，則需要將重組質粒導入山羊的受精卵中。

答案：(1)C、H、O、P(2)否質粒A缺少標記基因，質粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復制原點會被限制酶切割，會影響重組質粒的自主復制(3)在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上能正常生長，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能正常生長在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基和含四環(huán)素的培養(yǎng)基上都不能正常生長(4)受精卵考向5生物技術的安全性和倫理問題

[典例5](2018年河南信陽模擬)生物技術是一把雙刃劍，既可以造福人類，也可能因使用不當給人類帶來災難。請回答下列有關生物技術的安全性和倫理性問題：

(1)由于科學發(fā)展水平的限制，在轉基因生物中，有時候會出現(xiàn)一些人們意想不到的后果，引發(fā)了人們在食物安全、生物安全和__________安全三個方面發(fā)生了激烈的爭論。

(2)在轉基因生物或產(chǎn)品研究過程中，絕大多數(shù)科學家都能自覺遵守科學研究道德。如對外源DNA進行認真選擇，避免產(chǎn)生對人體有毒性或過敏的________。

(3)為解決不孕不育夫婦的生育問題而出現(xiàn)了試管嬰兒技術，而2002年，英國一對夫婦通過設計試管嬰兒，利用新生兒臍帶血中造血干細胞，挽救患地中海貧血癥的男孩。這兩項技術的區(qū)別是____________________不需要經(jīng)過基因檢測。

[解析](1)轉基因生物的安全性在以下三個問題方面存在爭議：食物安全(滯后效應、過敏源、營養(yǎng)成分改變)、生物安全(對生物多樣性的影響)、環(huán)境安全(對生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響)；(2)在轉基因生物或產(chǎn)品研究過程中，需對外源DNA進行認真選擇，避免產(chǎn)生對人體有毒性或過敏的蛋白質；(3)設計試管嬰兒技術是通過體外受精獲得許多胚胎，然后從中選擇符合要求的胚胎，再經(jīng)移植后產(chǎn)生后代的技術。[答案](1)環(huán)境(2)蛋白質(3)試管嬰兒技術[考向預測]7.生物技術的迅猛發(fā)展挑戰(zhàn)了原有的社會倫理道德秩序，引起了激烈的爭論。

(1)支持者認為，克隆人是一項科學研究，應當有它內在的發(fā)展規(guī)律，允許有一定的發(fā)展。反對者則認為，克隆人沖擊了現(xiàn)有的婚姻、家庭和兩性關系等傳統(tǒng)的倫理道德觀念，克隆人是在人為地制造________________________________________都不健全的人。

(2)在針對克隆技術的爭論中，我國政府態(tài)度明確，及時立法，規(guī)范了克隆技術的應用。我國明確禁止生殖性克隆人，一再重申四不原則：不贊成、不允許、不支持、________任何生殖性克隆人的實驗。

(3)設計試管嬰兒與試管嬰兒在技術手段上的區(qū)別是___________________________________________，前者的生殖方式是____________。答案：(1)心理上和社會地位上(2)不接受(3)多了胚胎移植前進行遺傳診斷這一環(huán)節(jié)有性生殖考向6蛋白質工程

[典例6](2018年天津卷)甲型流感病毒為RNA

病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。

(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，利用________技術擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構建重組質粒，并保存。

(2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。

(3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加______________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。A.病毒的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶

B.宿主的DNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶

(4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起_______免疫，增強免疫保護效果。

[解析](1)體外進行DNA擴增采用的技術手段是多聚酶鏈式反應(PCR技術)。將基因內個別編碼氨基酸的序列改造成編碼終止密碼子的序列后，在翻譯時終止密碼子提前出現(xiàn)，不能合成完整長度的多肽(或蛋白質)。(2)為了使目的基因能夠在受體細胞中穩(wěn)定存在并正常表達，需要將目的基因與載體(