第三章 液相色譜法

第三章液相色譜法第1頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月2第2頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月3液相色譜儀（2）第3頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月4液相色譜儀（3）第4頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月5北京瑞利第5頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月6

§3-1概述高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率

和實現(xiàn)了自動化

操作。

高效液相色譜法是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術.第6頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月7高效液相色譜經(jīng)典色譜第7頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月8經(jīng)典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.5

107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。第8頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月9和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動相組成。

液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。

§3-1概述一、液相色譜分離原理及分類第9頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月10液相色譜分離的實質是樣品分子（以下稱溶質）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。

§3-1概述

根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。第10頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月11二、液相色譜與氣相色譜的比較

液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動相，而液體和氣體的性質不相同；此外，液相色譜所用的儀器設備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差別，主要有以下幾方面：第11頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月12氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離、分析較為困難。致使其應用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機物能用氣相色譜分析；液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或對熱敏感的物質、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機物的70~80%。

二、液相色譜與氣相色譜的比較（1）應用范圍不同第12頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月13

因為：①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。

二、液相色譜與氣相色譜的比較（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作第13頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月14②液相色譜固定相類型多,如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。

③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。二、液相色譜與氣相色譜的比較第14頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月15（3）由于液體的擴散系數(shù)比氣體的小105倍，因此，溶質在液相中的傳質速率慢，柱外效應就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴張可以忽略不計。（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復雜，價格昂貴。在實際應用中，這兩種色譜技術是互相補充的。二、液相色譜與氣相色譜的比較第15頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月16

綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優(yōu)點。該法已成為現(xiàn)代分析技術的重要手段之一，目前在化學、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農業(yè)等科學領域獲得廣泛的應用。

§3-1概述第16頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月17§3–2高效液相色譜儀第17頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月18§3–2高效液相色譜儀高效液相色譜儀的結構示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相經(jīng)過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入待分離的樣品時，流經(jīng)進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第18頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月19貯液器高壓泵檢測器梯度淋洗裝置色譜柱壓力表進樣器餾分收集器高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)第19頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月20高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)第20頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月21第21頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月22

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是儀器最重要的部件：由儲液罐、高壓輸液泵**、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。

對高壓輸液泵的要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。1.高壓輸液系統(tǒng)§3–2高效液相色譜儀第22頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月23常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種?！?–2高效液相色譜儀恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn)性差它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵比恒壓泵優(yōu)越，使用較普遍恒流泵分機械注射泵和機械往復泵**兩種第23頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月24高壓輸液泵：主要部件之一，壓力：150～450×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。第24頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月252．進樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5-30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。

第25頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月26

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：第26頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月27準備狀態(tài)進樣狀態(tài)流動相入口色譜柱入口樣品出口樣品入口流動相入口色譜柱入口樣品環(huán)第27頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月283分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技術的性能不受影響。第28頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月29柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經(jīng)沖洗后，即可備用。

對色譜柱的要求：柱效高，選擇性好，分析速度快等。

第29頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月30第30頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月31使用色譜柱注意事項：1溶劑要脫氣，溶劑和樣品應過濾，防止堵塞。2加前置柱。3更換流動相要漸變。4用后要保護好。第31頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月324．檢測系統(tǒng)

HPLC與GC一樣，要求檢測器靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準確，對溫度和流速的變化不敏感，應用范圍廣，線性范圍寬等優(yōu)點檢測器分為兩大類：一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:第32頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月33HPLC中應用最廣泛的檢測器。它的原理基于待測組分對特定波長的紫外或可見光的選擇性吸收，試樣濃度與吸光度的關系服從朗伯-比爾定律。高效液相色譜檢測器：（1）紫外光度檢測器（UV）優(yōu)點：靈敏度高，選擇性好，對流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度淋洗，線性范圍寬，適用于痕量分析。最小檢測量10-9g·mL-1。第33頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月34高效液相色譜檢測器：（1）紫外光度檢測器（UV）缺點：只適用于檢測能吸收紫外、可見光的物質，流動相選擇受限制。要求流動相在測定波長下無吸收。第34頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月35光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第35頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月36

檢測器是一種通用型檢測器。它的作用原理是純流動相與包含樣品的流動相之間的折射率不同，檢測器把這種差值檢測出來，給出信號，信號的大小與樣品含量成正比。純流動相與待測組分的折射率相差越大，檢測器靈敏度越高，靈敏度可達10-7g·cm-3。通用性強，不破壞樣品，線性范圍寬。主要缺點是靈敏度低，不適宜痕量分析。對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）熒光檢測器（4）電導檢測器

（2）示差折光率檢測器第36頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月37它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置.HPLC梯度淋洗與GC中的程序升溫一樣。

對于某些復雜樣品，組分的k′范圍很寬，用一種強度的溶劑淋洗時不能得到很好的分離，采用梯度淋洗。就是組成流動相的兩種或兩種以上不同的溶劑按一定程序改變配比、極性、pH、離子強度、通過流動相極性的變化來改變待分離樣品的選擇因子和tR，提高分離效果和分析速度。5、附屬系統(tǒng)第37頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月38梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內梯度:

一臺高壓泵,通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第38頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月上節(jié)課內容回顧液相色譜特點液相色譜儀的組成高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)第39頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月403-3高效液相色譜的固定相和流動相（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。

固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。第40頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月411.表面多孔型固定相

它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。

第41頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月422．全多孔型固定相它由直徑為10μm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（5～10μm），孔仍然較淺，傳質速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析.第42頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月43（二）流動相由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。表中列出了一些常用溶劑的紫外截止波長。第43頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月44

對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。第44頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月45（3）高純度。由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產生“偽峰”。痕量雜質的存在，將使截止波長值增加50～100

nm。（4）化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。(5)低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離.第45頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月46流動相及流動相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。第46頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月47流動相組成

流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。第47頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月481.吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過在載體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在載體表面。3-4高效液相色譜法的主要類型及選擇HPLC根據(jù)分離機理的不同分為幾種類型：第48頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月49高效液相色譜法的主要分離類型3.離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠；第49頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月503-4高效液相色譜法的主要類型及選擇一、液一液分配色譜法（LLPC）

在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1．分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。第50頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月51

2、固定相

由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′一氧二丙腈，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。為了更好解決固定液在載體上流失問題。產生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學鍵合固定相上進行的。詳細介紹見后。

第51頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月523．流動相

在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。

如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。

如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。

第52頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月53二、化學鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。

由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。第53頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月541．鍵合固定相類型用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機分子可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）離子交換基團如作為陰離子交換基團的胺基，季胺鹽；作為陽離子交換基團的磺酸基等.第54頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月552．反相健合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇—水、乙腈一水、水和無機鹽的緩沖溶液等。

它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液為流動相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點。

第55頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月563.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機基團，CN、NH2雙羥基等鍵合在硅膠表面作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動相，分離極性化合物。此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。

這種色譜方法主要用于分離異構體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。第56頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月574.離子性鍵合相色譜法

當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質，化學鍵合各種離子交換基團，如一SO3H一CH2NH2、－C00H等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。

以上討論了各種類型化學鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。此外，由于鍵合到載體上的基團不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計，在高效液相色譜法中，約有80％的分離問題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點是不能用于酸、堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動相的體系。第57頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月58

第58頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月59三、液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質是根據(jù)物質在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。1．分離原理當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內，與流動相溶劑分子（S）在固定相表面發(fā)生競爭吸附:X+nS吸附=X吸附+nS第59頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月60

X+nS吸附=X吸附+nS達平衡時，有其中K為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。K值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。K值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。第60頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月612．固定相吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，因此，以硅膠用得最多。在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。第61頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月623、流動相一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。第62頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月63四、離子交換色譜法（IEC）此法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子。因此，應用范圍較廣。第63頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月641．離子交換原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質電離后產生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下：陽離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A第64頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月65

2．固定相作為固定相的離子交換劑，其基質大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分（見下表）第65頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月66第66頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月673．流動相離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）水的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。關于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

第67頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月68五、凝膠色譜法（SEC）

凝膠色譜法又稱尺寸排阻色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。

尺寸排阻色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質相對分子質量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結構的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必須大于10％才能得以分離。第68頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月69

1．分離原理

凝膠色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學情性多孔物質——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖：第69頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月70第70頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合物溶液進入色譜柱后，由于濃度差，所有溶質分子都力圖向凝膠表面孔穴滲透。體積較小的分子——既能進入較大的孔穴，也可以進入較小的孔穴，向孔內擴散的較深；體積較大的分子——只能進入較大的孔穴；體積更大的分子——不能進入孔穴，只能從凝膠的空隙流過。第71頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合物試樣進入色譜柱后處于溶劑的淋洗之下：1)高分子量級分在柱內停留時間很短，很快就被溶劑淋洗出來；2)分子量中等級分在柱內的停留時間較長，它們隨淋洗液緩慢的帶出；3)分子量最小的級分在柱內的停留時間最長，最后被溶劑淋洗出；按照淋出的先后順序，依次收集到分子量從大到小的各個級分，從而達到對聚合物分級的目的。第72頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月732．固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。

所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結構的多聚體。（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分離。第73頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月743．流動相

排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小。選擇溶劑還必須與檢測器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品，以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第74頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月二、GPC結構和儀器工作示意圖試樣和溶劑注入系統(tǒng)，主要包括：溶劑儲槽、脫氣室、過濾器、精密計量泵、進樣裝置；色譜柱系統(tǒng)，包括柱溫控制箱；檢測系統(tǒng)——各種檢測器（RI、UV等）；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（包括模數(shù)轉換器、計算機、打印機/繪圖儀等）；控制系統(tǒng)。第75頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月第76頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月溶劑的選擇在凝膠色譜分離中,溶劑是流動相，它的作用沒有其他液相色譜重要。樣品中不同分子量級分的分離并不依賴于溶劑與樣品之間的相互作用力。因此溶劑的選擇主要是從對樣品的溶解能力,溶劑與儀器的匹配以及實驗結果處理的方便來考慮。第77頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜柱系統(tǒng)包括參與柱、分離柱和柱溫控制箱。色譜柱是一支內部裝有凝膠填料的不銹鋼管。柱內凝膠材料的選擇很重要，要有較高的分離效果、良好的化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性，同時還要求有較好的機械強度和低流動阻力。交聯(lián)PS凝膠——適用于非極性有機溶劑。多孔硅膠——化學惰性、熱穩(wěn)定性、機械強度好、可以在柱中直接更換溶劑。多孔玻璃——水溶液體系第78頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠色譜柱的選擇1）根據(jù)滲透極限和分離范圍進行選擇；通?？刹捎么钆渲拥姆椒?將不同規(guī)格的凝膠柱串聯(lián)起來,可以起到更好的分離效果；2）根據(jù)溶劑體系——水溶性/油溶性；3）考慮凝膠的熱穩(wěn)定性、機械強度和化學惰性差。第79頁，課件共87頁，創(chuàng)作于2023年2月3.檢測系統(tǒng)檢測器的作用是將色譜柱淋出液中樣品的組成、含量的變化轉化為可供檢測的信號，從而完成定性、定量的判斷分離情況的任務。用于GPC的檢測器很多，包括：示差折光檢測器——適用于所有聚合物的檢測；紫外/紅外檢測器——適用于對該檢測器有特殊響應的聚合物。自動餾分收集器——自動計算出淋出液的體積；由此得到隨