成體動物皮膚細胞體外培養(yǎng)

成體動物皮膚細胞培養(yǎng)一，豬耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：取材：在種豬場，選取1-6周齡幼豬，盡量挑選豬耳組織上血管較細少的部位，用刮毛刀刮毛后，無菌取一塊豬耳組織，將組織塊放入含有250iu/ml青霉素和250gg/ml鏈霉素的無菌PBS中，4°C保溫立即帶回實驗室。酶消化法分離培養(yǎng)豬耳皮膚成纖維細胞：在超凈臺上，將豬耳組織塊浸入到70%酒精10-30S，然后置于無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪去毛，用含有100iu/ml青霉素和100gg/ml鏈霉素的無菌PBS涮洗3-5遍，在PBS中將豬耳組織塊剪碎成1-3mm3的小塊，并將豬耳組織塊等分到兩個培養(yǎng)瓶中，分別采用胰蛋白酶熱處理法與胰蛋白酶冷熱處理結(jié)合法分離細胞。(1)胰蛋白酶熱處理法待組織塊下沉后，吸去上清，向其中一個培養(yǎng)瓶中加入含有0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA的消化液，密封瓶口后，置于37C下消化30min,中間搖勻數(shù)次，消化結(jié)束后，收集含有解離下來細胞的消化液，置4C冰箱內(nèi)冷卻，在所余組織上再一次加入消化液，重復(fù)上述消化步驟四次，并將每次收集到的含有細胞的消化液混合到一起，離心去上清，重懸于1ml37C預(yù)溫的DMEM/F12(GIBCO)培養(yǎng)液(含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100gg/ml鏈霉素)，吹打均勻后，將1滴細胞懸液與2滴2%的臺酚藍液混合后，滴入細胞計數(shù)板，2min后，在顯微鏡下計數(shù)至少299個細胞，未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞，計算活細胞百分比。(2)胰蛋白酶冷熱處理結(jié)合法向另外一瓶中加入少量含0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA的消化液，置于4C冰箱。冷消化1-2h,改為用37C培養(yǎng)箱繼續(xù)進行消化。30-60min后加入1ml37C預(yù)溫的DMEM/F12培養(yǎng)液(含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100gg/ml鏈霉素)，吹打均勻后，用上述的臺酚藍排出檢測法計算活細胞的百分比。最后用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至5x105--1x106cell/ml.將培養(yǎng)瓶置入到37C，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48-72h后觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁后更換一半或全部培養(yǎng)液，次后每隔兩天更換一次培養(yǎng)液。二，人類皮膚成纖維細胞培養(yǎng)：(來自：成纖維細胞培養(yǎng)方法的改良)取材前用肥皂水洗凈局部，酒精消毒不用碘酊，待干后用取皮器取材，深度至真皮而不必深至皮下組織。取材后以皮下組織無出血最合適，立即將組織浸入HamF10加抗菌素溶液中浸泡1小時并送實驗室。然后，將組織自浸泡液中取出，F(xiàn)10溶液沖洗2次，在平皿中用眼科剪剪碎成2mm2的組織塊，貼于含2.5ml培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，使瓶立直4-6小時后，平置，以保證組織塊不脫壁。培養(yǎng)液選擇HamF10+小牛血清+Hepes+抗菌素為復(fù)合培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)ph為7.2-7.4HamF103.675g碳酸氫鈉 0.45g小牛血清20%谷氨酰胺 150mgHepes2.383g抗菌素青霉素100iu/ml,鏈霉素100gg/ml在接種后第5天，給予換液，容積25ml的培養(yǎng)液內(nèi)加2.5ml培養(yǎng)液，40ml培養(yǎng)瓶中加4ml培養(yǎng)液，一般7-10天開始長出成纖維細胞，倒置顯微鏡下見組織塊周邊滋生出梭型，遮光性好的透明細胞，以后3天換液一次，到14-16天可見圓形細胞較多時，進行傳代。三，廣西巴馬香豬耳皮組織細胞培養(yǎng)取材：挑選耳部血管較細少的部位，無菌取一小塊豬耳組織，先在生理鹽水中清洗2次，然后放入75%酒精中浸泡30-60S,再在含有抗菌素的PBS液中依次漂洗3次，接著置于含有少量PBS的無菌皿中，用無菌眼科剪，刀片刮去毛和表皮組織，并去除軟骨，保留真皮層，再次用酒精浸泡30-60S，耳后再移入PBS液中漂洗4次，待用。原代組織塊法：取上述處理的部分組織，在含有10%NCS+DMEM液的無菌平皿中，用眼科剪剪成1-3mm3左右的小塊，移入預(yù)先涂布明膠孵育的培養(yǎng)皿中，均勻地平鋪到培養(yǎng)皿底部，組織碎塊間間距以0.5厘米為宜。將培養(yǎng)皿倒置放入37°C5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h,后加入少量培養(yǎng)液，正置培養(yǎng)20h后補加培養(yǎng)液，以漫過組織塊為宜，在培養(yǎng)箱中每隔3-4天換液1次。組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)第1天即可貼壁，5天后部分組織塊周圍游離出成纖維細胞，少量的成纖維細胞一經(jīng)貼壁生長。7天后大部分組織塊周圍游離出成纖維細胞貼壁生長，9天后組織塊周圍有大量的成纖維細胞包繞，成纖維細胞生長旺盛，但組織塊間仍有間隙，大約13-15天間隙消失。由于動物皮膚直接與自然環(huán)境接觸，不可避免會帶有很多的細菌等微生物，所以，取材時必須先去毛，其次要用75%乙醇浸泡消毒最好30-60S，不可超過60s，否則會對細胞造成損傷，影響細胞貼壁生長。耳部組織塊含有表皮層，真皮層，軟骨，取材時盡量去除表皮和軟骨。如果軟骨不去除會增加組織塊的厚度，影響組織塊的貼壁，不易于日后組織塊的誘出，如果表皮未去除，一則由于表皮過硬，不易剪碎，在貼壁時容易造成組織塊干燥脫水，細胞不易獲取營養(yǎng)，從而引起細胞破壞死亡，組織塊脫落，并且，這種混合生長表皮細胞對后續(xù)試驗產(chǎn)生影響。但是由于組織塊很小，直接去表皮操作比較困難，且延長了取材時間，也容易造成污染，所以用0.25%胰蛋白酶消化液4C冷處理過夜后，組織塊疏松，有點黏糊，直接用鑷子和眼科剪可以輕輕剪下表皮。四，1，實驗所需要的儀器列表：麻醉用具：皮下注射針，20ml過濾注射器蒸餾水，戊巴比妥鈉，止血鉗，手術(shù)刀片和刀柄，肥皂，75%乙醇，碘酊，鑷子，剪毛剪，眼科剪，培養(yǎng)用具：玻璃棒，膠頭移液管，1000ml容量瓶，100ml燒杯2只，500ml燒杯。10ml離心管，培養(yǎng)皿(35mm,60mm)3，5ml離心管，50ml離心管，血球計數(shù)板，50ml細胞培養(yǎng)瓶.實驗動物：1歲雌金黃地鼠所需溶劑：樣品暫存液(4CPBS)，樣品洗滌液(PBS)，無鈣鎂離子PBS:氯化鈉8g/l氯化鉀0.2g/l磷酸氫二鈉1.44g/l磷酸二氫鉀0.2pg/l去離子蒸餾水加至1L。用1M鹽酸調(diào)節(jié)ph，用于組織培養(yǎng)時要求ph為7.2終止消化液：DMEM/F12+10%FBS+100IU/ml青霉素+100pg/ml鏈霉素其配置參照“培養(yǎng)基大全”消化液：0.25%胰蛋白酶消化液即0.25g胰蛋白酶和100mlPBS.先用少量PBS溶液溶解胰蛋白酶，然后將余液緩緩加入，置室溫4小時或置于37°C水浴中，溶解lh(時間長短取決于溶解程度，待溶液全部透徹清亮為止)并不斷攪拌振蕩，盡量減少泡沫的產(chǎn)生。待完全溶解，溶液全部透徹清明時，然后過濾除菌，在超凈臺內(nèi)用注射濾器即0.22pm微孔濾膜，進行抽濾除菌。然后分裝到10ml離心管中密閉分裝，貼好標簽。用濾器過濾，分裝置20C冰箱中保存。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用7.4%NaHCO3溶液調(diào)pH至7.6-7.8左右。完全培養(yǎng)液：DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基+10%FBS+10ng/mlEGF+5pg/mlInsulin+100IU/ml青霉素+100闖/ml鏈霉素DMEM+20%FCSM199+10%NCS+100IU/ml青霉素+100IU/ml鏈霉素M199+100IU青霉素+100IU/ml鏈霉素+50pg/ml兩性霉素B+5pg/mlM-plasmocinTM+2mmol/lL-GLu+10pg/ml的胰島素+40ng/mlEGF+20%FBS2,金黃地鼠尾中部背部皮膚的采集：麻醉：麻醉前給藥，阿托品(Atropine),0.002--0.005mg/100gBW(肌肉注射，皮下注射)。注射麻醉藥，戊巴比妥鈉(pentobarbital)，6.0mg/100gBW(腹腔注射)；采集：然后在尾中部背側(cè)剃毛消毒(碘酒消毒后立即用75%酒精脫碘)后，用止血鉗夾起皮膚，再用手術(shù)刀片切割夾起的皮膚，取大小為1.0x0.5cm2的組織塊.保存：然后迅速將其放入高濃度青鏈霉素(500IU/ml青霉素+500四/ml鏈霉素)的4C的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中暫存。3，皮膚成纖維細胞的分離：沖洗：皮膚組織塊在含青鏈霉素(100IU/ml青霉素+100四/ml鏈霉素)的PBS緩沖液培養(yǎng)皿中洗滌數(shù)遍，去血污及毛發(fā)，然后用眼科剪剪成1mm3大小的小塊，在剪切過程中，向組織塊加入1?2滴培養(yǎng)液,以保持濕潤。再用上述PBS緩沖液清洗至液體清亮，靜置，去上清。分份：將剪后的小塊分裝到兩個離心管中，進行如下兩種消化培養(yǎng)：胰蛋白酶消化：在37°C下用胰蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶）持續(xù)酶解20-40min,期間振蕩4-5次，待皮膚組織呈絮狀時，用等體積培養(yǎng)液（DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基+10%FBS+100IU/ml青霉素+100四g/ml鏈霉素）中止酶解，吸管吹吸打散,（或者在4C條件下過夜消化）1000rpm離心洗滌上層清液1?2次，然后將細胞團用完全培養(yǎng)液（DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基+10%FBS+10ng/mlEGF+5gg/mlInsulin+100IU/ml青霉素+100闖/ml鏈霉素）進行重懸浮，用血球計數(shù)法測量細胞的密度，按照2x105/60mm培養(yǎng)皿細胞密度，在飽和濕度，5%CO2,37C的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。組織塊貼壁：方法一：將剪切好的組織碎塊用吸管移入培養(yǎng)瓶中，均勻地平鋪于50ml培養(yǎng)瓶底部，組織小塊間距以0.5cm為宜，加入微量的含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶或者先在此培養(yǎng)液中浸泡后在放入瓶底，另瓶底向上，翻瓶時勿另組織小塊流動，于39C飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h左右，待組織塊粘著牢固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并補加適量培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液慢慢浸潤組織塊，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補加培養(yǎng)液，之后隔天換液一次。方法二：或者將皮膚組織小塊移人六孔板（Corning，353014），每孔3?4塊組織小塊，用微量移液槍在組織小塊的周緣滴加微量完全培養(yǎng)液（是含有10%NCS,100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素的M199）在飽和濕度，5%CO2,37C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,之后再加少量完全培養(yǎng)液（不浸沒組織塊）繼續(xù)培養(yǎng)24h，最后加完全培養(yǎng)液浸沒組織塊。之后每2d更換2/3的培養(yǎng)液。在培養(yǎng)初期勿使組織塊浮動，三天后開始換液，之后每兩天換液一次。方法三：或者是將組織塊放入添加有100IU/ml青鏈霉素，5pg/ml兩性霉素B(sigma,171375)、(5pg/mlM-plasmocinTI4ivoGen,晶美分裝，24-103-MPP)、2mmol/lL-Glu(GibcoBRL,