第七章外源基因的表達及其優(yōu)化策略

第七章外源基因的表達及其優(yōu)化策略第1頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院本章重點掌握內(nèi)容基因表達的關(guān)鍵要素及要求影響外源基因表達的因素表達產(chǎn)物的純化甲醇酵母表達系統(tǒng)第2頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素基因表達：從DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息,通過密碼子和反密碼子系統(tǒng),轉(zhuǎn)變由特定氨基酸順序構(gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子過程，從而決定生物有機體遺傳表型。第3頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程?；蚬こ讨谢蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素第4頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素

基因表達

遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）。

第5頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素克隆基因的表達

外源基因在宿主細胞中表達

外源基因

表達載體

重組載體

導(dǎo)入宿主細胞

在宿主細胞中表達出蛋白質(zhì)

提取蛋白

宿主細胞：

原核細胞或真核細胞第6頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素第7頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素

影響外源基因表達的因素主要有：

閱讀框架

順式作用元件

翻譯過程

表達體系第8頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素

一、閱讀框架對轉(zhuǎn)化基因的影響

什么是閱讀框架(openreadingframe,ORF)?

二、順式作用元件對基因表達的影響

1.對基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控

1)啟動子

2)增強子

3)沉默子第9頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素

二、順式作用元件對基因表達的影響

2.對基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控

1)終止子

2)衰減子

3.對DNA結(jié)構(gòu)的影響

1)核基質(zhì)結(jié)合區(qū)

2)絕緣子

3)基因座控制區(qū)第10頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)影響外源基因表達的因素

三、翻譯過程對表達的影響

1.翻譯起始對基因表達的影響

2.密碼子偏愛性對基因表達的影響

3.翻譯終止對基因表達的影響

四、表達系統(tǒng)對表達產(chǎn)物的影響第11頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

外源基因表達系統(tǒng)由基因表達載體和相應(yīng)的受體細胞兩部分組成。宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。

目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母，已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法。許多外源基因已獲得成功表達。第12頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達用原核生物作宿主。

AdividingE.coli

原核或噬菌體啟動子

MCS

SD序列

終止子

第13頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征

大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢

全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架

基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善

繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定

被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物第14頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的劣勢

缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白真核與原核生物結(jié)構(gòu)上存在差別第15頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

一、原核生物細胞表達的特點

1.原核生物只有一種RNA聚合酶識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。

2.原核生物的表達是以操縱子為單位的。Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。第16頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

一、原核生物細胞表達的特點

3.原核生物的轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。

4.原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。

5.原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物直接控制要慢。第17頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行第18頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

一、原核生物細胞表達的特點

6.在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個翻譯起始密碼子及同16SRNA3’末端堿基互補的序列，即SD序列。

Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一個啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。第19頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

二、外源基因在原核細胞中表達具備條件

1.通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。

2.外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA。

3.必須利用原核細胞的強啟動子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達。

4.外源基因與表達載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(ORF)。

5.利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達，防止外源基因的表達產(chǎn)物對宿主菌的毒害。

第20頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

原核生物基因表達載體的組成特征

啟動子

核糖體結(jié)合位點(SD序列)

終止子

選擇標記基因

復(fù)制子原核生物基因表達的受體系統(tǒng)

大腸桿菌受體系統(tǒng)、芽孢桿菌受體系統(tǒng)

鏈霉菌受體系統(tǒng)、藍藻受體系統(tǒng)第21頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院大腸桿菌表達載體的基本成分第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第22頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。

（1）啟動子序列

大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensussequence）。

-35Box和

-10Box

第23頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達不同啟動子的consensussequences

第24頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（1）啟動子序列

-35box：RNA聚合酶

亞基的識別位點

。

5’-TTGACA-3’

-10box（PribnowBox）：5’-TATAAT-3’

TTGACA

TATAAT轉(zhuǎn)錄起始位點

17bp

5’

核糖體結(jié)合位點

第25頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達原核啟動子共有序列的功能

三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（1）啟動子序列第26頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

三、原核生物基因表達的調(diào)控

1.啟動子

（2）翻譯的起始位點

a)核糖體結(jié)合位點（

ribosomebindingsite,RBS）

Shine-Dalgarno（SD）

sequence：

mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。

S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯

b)起始密碼：位于SD序列下游

AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）第27頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

2.RNA多聚酶大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。

第28頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.

轉(zhuǎn)錄終止子在表達載體克隆位點的下游一般設(shè)計一段轉(zhuǎn)錄終止子。

啟動子

操縱區(qū)S-D序列

目的基因

終止子

第29頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子

原理：

莖環(huán)結(jié)構(gòu)反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA與DNA的互作

多聚A/U由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。

第30頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子第31頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

3.轉(zhuǎn)錄終止子第32頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達三、原核生物基因表達的調(diào)控

4.翻譯終止密碼大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。

5.翻譯增強子（Translationenhancer）能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。

T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）;

大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段第33頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體1.非融合型表達載體載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點：產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第34頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結(jié)構(gòu)組成：

1）強啟動子:tac（trp-lac）

2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。

trp的-35區(qū)

lacUV5的-10區(qū)

lac操縱基因

第35頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結(jié)構(gòu)組成：

3）調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。

如JM105菌。

4）終止子：rrnB的強終止子

S-D序列和插入位點區(qū)：S-D

插入位點區(qū)

LacI

第36頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：結(jié)構(gòu)組成：

6）載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。

7）表達誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）

tacP

LacO

S-D

插入位點區(qū)

rrnBT

宿主lacI

阻遏物

IPTG

第37頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

1.非融合型表達載體

pKK223-3載體：條件：必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌。第38頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。

如：pINIII系列：pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,第39頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體

pINIII系列組成結(jié)構(gòu)

1）強啟動子：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。

2）調(diào)節(jié)基因：lacI。

3）S-D序列和起始密碼ATG。

4）分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。

5）插入位點區(qū)（多克隆位點）。Ipp

lacP

lacO

S-D/ATG

ompa

插入位點

第40頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達pINIII-comA1

四、常用大腸桿菌表達載體

2.分泌型表達載體第41頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。如：pGEX系列優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化。組成結(jié)構(gòu)：

1）啟動子：tac

2）操縱基因：lacP

3）調(diào)節(jié)基因：lacI

4）S-D序列

5）ori：pBR322ori6）融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）第42頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列l(wèi)acI

taclacO

S-D/ATG

GST

插入位點

TGA

lacP

GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。產(chǎn)物提純:第43頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列

產(chǎn)物分離:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。

第44頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達pGEX-2X的插入?yún)^(qū)pGEX-1X的插入?yún)^(qū)pGEX-3X的插入?yún)^(qū)四、常用大腸桿菌表達載體

3.融合蛋白表達載體系統(tǒng)

pGEX系列插入?yún)^(qū)第45頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達四、常用大腸桿菌表達載體

4.其他融合蛋白系統(tǒng)

His-tag（組氨酸標簽）在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。

His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。第46頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式位于細胞質(zhì)細胞周質(zhì)細胞外表達產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第47頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達細胞質(zhì)中表達:

外源基因在大腸桿菌寄主細胞質(zhì)中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。包涵體：存在于細胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。第48頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的

目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：

表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單；

能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總

蛋白的20%～40%。

目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種：

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中

在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。第49頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達周質(zhì)中表達：

周質(zhì)：在大腸桿菌一類革蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細胞質(zhì)中穿過細胞質(zhì)內(nèi)膜進入周質(zhì)。第50頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達胞外表達：

使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化。途徑：

1.用大腸桿菌細胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）2.誘導(dǎo)大腸桿菌細胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）第51頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

1.包涵體蛋白

本質(zhì)：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集

包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。

優(yōu)點：易于分離純化第52頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體及其性質(zhì)

在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。

包涵體基本由蛋白質(zhì)組成，其中大部分是外源基因的表達產(chǎn)物，具有正確的AA序列，但空間構(gòu)想往往是錯誤的，因而沒有活性，此外，它還含有受體細胞本身高效表達的蛋白產(chǎn)物（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及質(zhì)粒的編碼蛋白，其第三種組分是DNA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。第53頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作

包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白。第54頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體表達形式的缺點

以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過

有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。

經(jīng)過復(fù)性處理的目標蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當?shù)?，一般不超過30%

復(fù)性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。第55頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達形成包涵體的原因：

缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶，使中間體大量積累。缺乏蛋白質(zhì)折疊過程中需要的某些酶和輔因子，或環(huán)境不適無法形成正確的次級鍵。表達水平（重組異源蛋白過量表達）。細菌的遺傳性狀。異源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。第56頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達減少形成包涵體的策略：

降低重組菌的生長溫度添加可促進重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑（高濃度多醇類、蔗糖）供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)基（供氧、pH等）第57頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體的分離：

菌體破碎（高壓勻漿、高速碾磨、低溫反復(fù)凍融等）離心收集（高速離心）清洗（去污劑和低濃度變性劑洗滌以除去脂類和膜蛋白）第58頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體的變性與復(fù)性操作

包涵體的溶解與變性

包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。

能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：

清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸

促溶劑鹽酸胍、尿素

混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)第59頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊

包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)：

將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性第60頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達伸展態(tài)后期中間體中間體聚集體（聚集過程）天然態(tài)（復(fù)性過程）快慢慢

包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性效率取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭，涉及兩種疏水作用：分子內(nèi)疏水相互作用，可促進正確折疊；部分折疊肽鏈分子間的疏水相互作用，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。第61頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達一個有效、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備的特點：

活性蛋白質(zhì)的回收率高

正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊的蛋白質(zhì)分離

折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品折疊復(fù)性方法易于放大復(fù)性過程耗時較少第62頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

2.融合蛋白

將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，這種方式表達的蛋白.

優(yōu)點：

穩(wěn)定性加強；具有較高的水溶性和一定的生物活性；能高效表達；易于分離純化.第63頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個或兩個以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。其中通常受體細菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。第64頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

融合蛋白質(zhì)配偶體：指融合蛋白質(zhì)中與目標蛋白質(zhì)連接的別種蛋白質(zhì)組分。常見的配偶體：葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SPA)、鏈球菌蛋白質(zhì)G(SPG)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)

、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和硫氧還蛋白(Trx)。第65頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達融合蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建的三個原則：

首先，受體細菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達，且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要，它直接決定了融合蛋白的裂解方法。最后，當兩個蛋白編碼序列融合在一起時，外源基因的表達取決于其正確的翻譯閱讀框架。第66頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第67頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達用融合載體組合表達融合蛋白質(zhì)：

以Ecoli.lacZ為靶基因的組合最典型，含三個不同載體，每個載體都有一個lacZ啟動子和SD序列，且在lacZ基因下游部位具有一EcoRⅠ識別序列(GAATTC)5’上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對。三種情況必有一個保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出真實的融合蛋白質(zhì)。第68頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第69頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第70頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第71頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達大腸桿菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mtld)

引物引物1：5‘GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG3’引入BamHI酶切位點引物2：5‘TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3’引入SacI酶切位點全長1149bp，382個氨基酸，45kD第72頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達融合蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的優(yōu)點：

第一個顯著特點是穩(wěn)定性大大增加。第二個特點是融合蛋白質(zhì)的多肽片段有可能構(gòu)成信號肽序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)分配到細胞的正確部位。第三個特點是分離純化簡單。可根據(jù)受體細菌蛋白的特異性抗體、配體底物等迅速純化融合蛋白質(zhì)。第73頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達融合蛋白質(zhì)的純化

基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。第74頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達異源蛋白質(zhì)的回收：

將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種?；瘜W(xué)斷裂法：最佳試劑為溴化氰，作用于甲硫氨酸側(cè)鏈進行硫醚基反應(yīng)，后水解斷裂。蛋白質(zhì)酶法：每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點決定簇。試劑識別位點酶識別位點溴化氰Met-XXa因子Ile-Glu-Gly-Arg-X甲酸Asp-Pro凝血酶Gly-Pro-Arg-X羥胺Asn-Gly胰蛋白酶Arg-X枯草蛋白酶Gly-Ala-His-Arg-X第75頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達第76頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

五、外源基因在大腸桿菌中的表達形式

3.整合型外源蛋白

外源蛋白的基因序列在宿主細胞染色體的同源序列的介導(dǎo)下，整合到宿主細胞的染色體上，進行表達的方式。

4.分泌型外源蛋白

編碼的外源蛋白在某種機制下分泌到細胞外的這類蛋白。

優(yōu)點：

簡化純化處理工藝；減少外源蛋白降解的概率；有利于形成正確地空間構(gòu)想，獲得較好的生物活性或免疫原性第77頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達蛋白質(zhì)的外泌表達型

把所表達的目標蛋白外泌到細胞外的培養(yǎng)基中可以進一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。

目前成功的例子主要是采用以下方案:（1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達

（2）與一些能提高細胞外膜通透性的因子融合或共表達

（3）改變培養(yǎng)基的成分

歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。第78頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

六、提高外源基因表達效率的方法

1.選擇強啟動子序列，如tac

等

2.調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離

一般為5-9bp

距離過長或過短都影響真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離

3.改變起始密碼下面的幾組密碼子

能提高翻譯的起始效率

4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性第79頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關(guān)系

（1）誘導(dǎo)表達

將宿主生長代謝與外源基因表達分開

一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)

PL啟動子是溫度誘導(dǎo)型:

cI857

PL

外源基因

PO

第80頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

（1）誘導(dǎo)表達

tac啟動子是藥物誘導(dǎo)型

調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。

無IPTG

阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。

有IPTG

阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。第81頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達AmpR

PlasmidpGEX-KGGSTlacIq

PtacPromoterAmpr

IPTG第82頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達六、提高外源基因表達效率的方法

5.減輕宿主細胞的代謝負荷

（2）表達載體誘導(dǎo)復(fù)制

將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。

當宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。

當需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。

第83頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

防止被宿主的酶降解。（1）設(shè)計成融合蛋白

這是避免被降解的最好措施。

N末端：由原核基因編碼一段多肽，

C末端：是完整的真核外源基因。

質(zhì)?；虍a(chǎn)物

目的基因產(chǎn)物

N

C

切割

第84頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（2）

使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解

減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。

1)使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。

2)大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。

3)T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。第85頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白細胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保旱鞍踪|(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第86頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白

細菌蛋白分泌的條件：

有信號肽:位于N端，一般為15-30aa。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似,功能相似，可以互換。

堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點

Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶外源蛋白第87頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達六、提高外源基因表達效率的方法

6.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性

（3）表達分泌蛋白

細菌蛋白分泌的條件：

蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa序列:為蛋白指明目的地。

細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制:信號肽酶I、信號肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。

真核細胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達；

但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。第88頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達七、表達產(chǎn)物的檢測

1.westernblotting

前提是：表達產(chǎn)物是已知蛋白第89頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

七、表達產(chǎn)物的檢測

2.HPLC高效液相層析

第90頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達

七、表達產(chǎn)物的檢測

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳第91頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達七、表達產(chǎn)物的檢測

4.等電聚焦電泳第92頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達七、表達產(chǎn)物的檢測

5.雙向電泳第93頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

外源基因在原核細胞中的表達七、表達產(chǎn)物的檢測

6.免疫電泳

7.放射免疫測定

8.酶聯(lián)免疫吸附試驗第94頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)的區(qū)別？

1.原核表達系統(tǒng)的表達系統(tǒng)是原核細胞;真核表達系統(tǒng)則是在真核細胞里例如酵母細胞,昆蟲細胞,哺乳動物細胞中表達。

2.兩種表達系統(tǒng)都是通過含有原核或者真核啟動子以及其他其他表達相關(guān)元件的質(zhì)粒系統(tǒng)來實現(xiàn)外源基因的表達。

3.原核表達系統(tǒng)與真核表達系統(tǒng)相比,表達量效率便于優(yōu)化調(diào)整,表達量高.但用來表達真核來源的外源基因時,由于蛋白折疊和糖鏈修飾不同,因此其應(yīng)用受限.真核表達系統(tǒng)表達量相對較低,雖然酵母和昆蟲系統(tǒng)表達量相對較高,但是在表達哺乳細胞來源基因同樣存在折疊和糖鏈修飾的不足。

第95頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

一、真核生物基因表達與調(diào)控的特點

1.基因組DNA的存在形式可影響基因表達

2.轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián)

3.調(diào)控是多層次的

4.具有組織和細胞類型特異性

5.對信號分子反應(yīng)不同第96頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

二、真核生物基因表達載體的組成特征

第97頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

二、真核生物基因表達載體的組成特征

1.原核DNA序列

2.啟動子

組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異性啟動子、雜合啟動子

3.增強子

4.終止子

5.內(nèi)含子

6.polyA加尾信號

7.選擇標記基因和報告基因第98頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

三、真核表達的受體系統(tǒng)

1.酵母表達系統(tǒng)

酵母是一類最簡單的真核生物,其生長代謝與原核生物相似；但在基因表達與調(diào)控方面類似于高等生物。

第99頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達

A酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征

酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng)。第100頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認定為安全的

基因工程受體系統(tǒng)（GRAS）酵母菌是最簡單的真核模式生物第101頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達B常用的宿主釀酒酵母宿主菌巴斯德畢赤酵母宿主菌乳酸克努維酵母宿主菌多型漢森酵母宿主菌

其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。

由畢赤酵母表達應(yīng)用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。第102頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達C酵母基因表達載體

酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達質(zhì)粒的構(gòu)建第103頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達DNA復(fù)制起始區(qū)（含兩類復(fù)制起始序列）選擇標記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等)第104頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難第105頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達酵母基因表達載體的種類：

YRp類（yeastreplicationplasmid

自主復(fù)制型質(zhì)粒）YEp類（yeastepisomalplasmid

附加體質(zhì)粒）YIp類（yeastintegrativeplasmid

整合型質(zhì)粒）YCp類（yeastcentromericplasmid

著絲粒質(zhì)粒）YAC酵母人工染色體第106頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建：

ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8--1.5kb，染色體上每30--40kb就有一個ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。

以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp以2μ質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為Yep

上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達50%--70%，主要是由于分配不均勻所致。第107頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建:在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第108頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建:

CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱YCpYCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1--5個第109頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達D酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細胞可達原生質(zhì)體總數(shù)的1--2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴重制約。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納多個質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25--33%。第110頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細胞的轉(zhuǎn)化

釀酒酵母的完整細胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍

共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見第111頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法

酵母菌原生質(zhì)體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達105/μgDNA。第112頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達酵母菌表達系統(tǒng)的選擇釀酒酵母表達系統(tǒng)

釀酒酵母基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。

釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌；且發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇。第113頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。

乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)。第114頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達1、畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此有利于擴大生產(chǎn)獲得高濃度細胞，從而進行高效表達2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達菌株3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcoholoxidase，AOX)基因的強啟動子特別適用于外源基因的調(diào)控表達巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)第115頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離5、畢赤酵母對外源蛋白產(chǎn)物進行N-乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為8～14個甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3連接的甘露糖殘基(有強的免疫原性)，因而適用于臨床應(yīng)用6、使用方便、簡單，而且成本較低第116頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達生長迅速乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子表達的可誘導(dǎo)性

已有百余種具有經(jīng)濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。第117頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達甲醇酵母表達系統(tǒng)⒈甲醇酵母的生物學(xué)AOX1andAOX2Mut+andMuts⒉表達載體和受體菌pPIC3.5K（胞內(nèi)表達）pPIC9.3K（分泌表達）pAO815（多拷貝表達）第118頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)

外源基因在真核細胞中的表達載體結(jié)構(gòu)上的共同點：5’AOX1重組位點MCS多克隆位點TT轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列3’AOX1重組位點His4重組位點篩選標記Ampr篩選標記第119頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月生命科學(xué)學(xué)院甲醇酵母表達系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)5'AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動外源蛋白的表達；α-因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點含多個酶切位點，為外源基因插入提供位點；

TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號；

HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志；

3'AOX1基因片段能夠與