樹突細(xì)胞成熟前后形態(tài)及其微絲蛋白的適應(yīng)性變化

樹突細(xì)胞成熟前后形態(tài)及其微絲蛋白的適應(yīng)性變化

current細(xì)胞（cd）是具有最強(qiáng)生物體功能的獨(dú)特抗原生動物抗生素（apc）。不僅可以直接激活t細(xì)胞的反應(yīng)反應(yīng)，還可以誘導(dǎo)免疫抗受，這在抗感染免疫、移植免疫和腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要作用。本試驗利用小鼠骨髓單核細(xì)胞經(jīng)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4誘導(dǎo)培養(yǎng)的未成熟樹突細(xì)胞(immatureddendriticcell,imDC),經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)imDC成熟,再利用異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)志的鬼筆環(huán)肽與細(xì)胞骨架微絲特異性結(jié)合的特性,觀察DC成熟前后微絲蛋白的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)變化,探索細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,從形態(tài)學(xué)方面獲得DC的功能情況。1材料和方法1.1te2000-u布置相關(guān)系數(shù)AirTech超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司),TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)(湘儀離心機(jī)廠),37℃恒溫水浴箱(DK-60,上海賀德實驗設(shè)備廠),NikonECLIPSETE2000-u倒置相差顯微鏡(invertedphasecontrastmicroscope,IPCM;尼康公司,日本),YCP-200二氧化碳孵箱(上海易亮醫(yī)療器械有限公司),leicaDM6000熒光顯微鏡(萊卡公司,德國),FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinsm公司,美國)。1.2實驗設(shè)備眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、巴氏管、離心管、6孔板和玻璃培養(yǎng)瓶等。1.3抗小鼠血清免疫因子t-rendth小鼠碳源分布重組小鼠GM-CSF、重組小鼠IL-4(Peprotech公司,美國),FITC標(biāo)志的鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin;Sigma公司,美國),胎牛血清(Gbico公司,美國),LPS(Sigma公司,美國),FITC標(biāo)志的抗小鼠主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)-Ⅱ抗體;PE標(biāo)志的抗小鼠CD11c和CD86抗體(EB公司,美國)、紅細(xì)胞裂解液(Sigma公司,美國)、多聚賴氨酸(Sigma公司,美國),RMPI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersolution,PBS)。1.4試驗對象C57小鼠,6～8周齡,雌性,6只(購于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。1.5測試方法1.5.1骨髓的沖洗頸椎脫位法處死C57小鼠,無菌狀態(tài)下取其股骨和脛骨并將其浸泡在RPMI-1640培養(yǎng)液中;用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液1mL,從骨干的一端刺入骨髓腔,將骨髓沖洗到一無菌培養(yǎng)皿中,反復(fù)4～6遍;收集培養(yǎng)皿中的骨髓細(xì)胞懸液,于380mm直徑的離心機(jī)1500r·min-1離心10min;棄上清液,加入5mL無菌Tris-NH4Cl溶液懸浮細(xì)胞溶解紅細(xì)胞,于室溫下靜置2min后,再次以380mm直徑的離心機(jī)1500r·min-1離心5min,棄上清液,收集沉淀的骨髓細(xì)胞。1.5.2小鼠gm-csf和il-4的流式鑒定先用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌收集的骨髓細(xì)胞,然后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液懸浮,均分至6孔培養(yǎng)板并在每孔中加入完全培養(yǎng)液至2mL,再加入重組小鼠GM-CSF至終質(zhì)量濃度10μg·L-1和IL-4終質(zhì)量濃度10μg·L-1;將培養(yǎng)板放入37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳的孵箱中培養(yǎng)48h;輕輕吹打細(xì)胞后連同培養(yǎng)液一起吸去懸浮細(xì)胞,僅保留貼壁細(xì)胞;加入新鮮的完全培養(yǎng)液以及相同質(zhì)量濃度的重組小鼠GM-CSF和IL-4,繼續(xù)培養(yǎng)至第5天;半量換液,同時追加相同質(zhì)量濃度的細(xì)胞因子;在培養(yǎng)的第6天,部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)用作DC的流式鑒定,另一部分細(xì)胞用作LPS刺激成熟試驗。細(xì)胞中加入質(zhì)量濃度為1mg·L-1的LPS,培養(yǎng)24h即第7天,培養(yǎng)48h即第8天。分別于常規(guī)培養(yǎng)的第3天、第5天以及LPS刺激的第1天、第2天,在倒置相差顯微鏡下行細(xì)胞觀察,經(jīng)電荷耦合器件采集成像,觀察懸浮細(xì)胞形態(tài)的變化情況。1.6木突細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分別培養(yǎng)至第5天、第7天,離心后收集細(xì)胞樣本,送流式細(xì)胞儀檢測樹突細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、MHC-Ⅱ和CD86的表達(dá)。1.7pahs方法在第6天時,向培養(yǎng)中的DC內(nèi)加入質(zhì)量濃度為1mg·L-1的LPS,按LPS刺激的時間將DC分成8、16、24、48h組,分別于不同時間點(diǎn)離心收集經(jīng)LPS刺激后的懸浮DC。將離心收集的DC滴加到多聚賴氨酸包被的玻片上,在室溫下靜置15min后,以體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛室溫下固定20min,PBS清洗2次,每次10min;體積分?jǐn)?shù)0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)室溫下作用10min,PBS清洗2次,每次10min;體積分?jǐn)?shù)0.5%的牛血清蛋白于37℃孵育40min,以封閉非特異性抗原,PBS輕洗2次,每次進(jìn)行10min;5mg·L-1(PBS稀釋)FITC-鬼筆環(huán)肽室溫下染色30～40min,PBS清洗2次,每次10min;體積分?jǐn)?shù)50%的緩沖甘油封片。上述過程均避光操作,然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu),并用圖像處理軟件ImageProPlus測定單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,試驗所得各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值以均數(shù)正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS11.0版統(tǒng)計軟件包作重復(fù)測量的方差分析,組間兩兩比較采用SNKq檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1懸浮細(xì)胞生長培養(yǎng)至第3天,大量貼壁的細(xì)胞聚集成簇,部分懸浮細(xì)胞成芽狀,少量細(xì)胞伸出樹枝狀突起,但突起較短較細(xì)(圖1);培養(yǎng)至第5天,大量具有典型樹枝狀突起的懸浮細(xì)胞觸突呈放射狀,并有少量懸浮細(xì)胞呈集落生長(圖2);培養(yǎng)至第7天,呈集落生長的懸浮細(xì)胞明顯增多,大量聚集成簇,懸浮細(xì)胞體積增大,部分形態(tài)不規(guī)則,伸出許多毛刺狀突起(圖3);培養(yǎng)至第8天,細(xì)胞開始程序性死亡,具有典型樹枝狀突起形態(tài)的細(xì)胞減少,細(xì)胞體積進(jìn)一步增大(圖4)。2.2cd11c、cd激勵、mhc-檢測結(jié)果細(xì)胞分別培養(yǎng)至第5天、第7天,經(jīng)離心收集細(xì)胞樣本,送流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá),結(jié)果提示各項指標(biāo)的檢出百分率見圖5。2.3lps刺激下細(xì)胞體積和微絲蛋白表達(dá)細(xì)胞分成未加LPS組(對照組)和加入LPS組(試驗組),按LPS刺激時間的不同,于熒光顯微鏡下分別觀察DC染色,微絲蛋白呈綠色熒光。培養(yǎng)至第5天,未經(jīng)LPS刺激的imDC(圖6A)體積較小,表面樹狀突起較短、較細(xì),樹狀突起和細(xì)胞膜微絲蛋白熒光強(qiáng)度較高,而細(xì)胞質(zhì)則熒光強(qiáng)度較低;LPS刺激8h組(圖6B),細(xì)胞體積有所增大,突起變長,細(xì)胞膜和突起的微絲蛋白表達(dá)增強(qiáng);16h組(圖6C),細(xì)胞體積進(jìn)一步增大,樹狀突起更為致密且怒張,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),而細(xì)胞膜熒光強(qiáng)度反而減弱;24h組(圖6D),細(xì)胞突起最長但松軟,細(xì)胞膜的微絲蛋白熒光表達(dá)仍然恢復(fù),但隱約可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微絲蛋白表達(dá);48h組(圖6E),細(xì)胞體積最大,細(xì)胞觸突重且變短、變細(xì),細(xì)胞膜周圍微絲蛋白熒光表達(dá)恢復(fù),與胞質(zhì)內(nèi)微絲蛋白分布一樣顯得稀疏且部分?jǐn)嗔选?.4白的高表達(dá)狀態(tài)LPS刺激后細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度增加。在24h內(nèi)微絲蛋白處于高表達(dá)狀態(tài),與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中,24h組差異最高(P<0.01);48h組平均熒光強(qiáng)度卻降低,但也高于對照組(表1)。3微絲結(jié)構(gòu)的變化APC在腫瘤的免疫治療中起重要的作用,也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。Young等認(rèn)為,有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)旨在產(chǎn)生以CD8+T細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,而且只有成熟的DC具有這一功能,未成熟的DC抗原呈遞和活化T細(xì)胞的能力較弱,所以本試驗采用LPS模擬腫瘤抗原,刺激DC分化成熟。在體外,LPS的短期刺激可使GM-CSF誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞來源的DC成熟,高表達(dá)MHC-Ⅱ和共刺激分子,表現(xiàn)為MHC-Ⅱ、共刺激分子和某些黏附分子表達(dá)增加,攝取抗原的能力降低,抗原呈遞能力增強(qiáng),刺激同種異基因T細(xì)胞增殖能力提高。細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成,其中微絲普遍存在于多種細(xì)胞內(nèi)并與多種膜蛋白構(gòu)成交聯(lián),在細(xì)胞形態(tài)的維持、運(yùn)動、分裂中起重要作用。微絲由肌動蛋白與肌動蛋白相關(guān)蛋白構(gòu)成,前者是其中的基礎(chǔ)蛋白,能較好地反映微絲結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化。肌動蛋白在細(xì)胞內(nèi)呈聚合態(tài),即以微絲蛋白和游離態(tài)G-肌動蛋白兩種狀態(tài)存在,微絲蛋白呈纖維狀,構(gòu)成細(xì)胞骨架微絲的主要部分;G-肌動蛋白為單體分子球形蛋白,溶于細(xì)胞質(zhì)。在正常細(xì)胞中,兩者處于動態(tài)平衡,其比例隨生理、運(yùn)動狀態(tài)和細(xì)胞周期的不同而有所變動,有各自的生化特點(diǎn),亦有許多共同的結(jié)合位點(diǎn)。兩者間的轉(zhuǎn)化受肌動蛋白解聚因子等多種因子的影響,兼具有自身調(diào)節(jié)功能。鬼筆環(huán)肽是一種由毒蕈產(chǎn)生的雙環(huán)桿肽,與微絲有強(qiáng)親合作用,可使肌動蛋白纖維穩(wěn)定,抑制解聚,且只與F-肌動蛋白結(jié)合,而不與G-肌動蛋白結(jié)合,故染色后僅見細(xì)胞中纖維狀的微絲結(jié)構(gòu)。本試驗顯示,imDC大部分貼壁生長,并在培養(yǎng)板底部聚集成簇,隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸懸浮,轉(zhuǎn)變?yōu)榘霊腋顟B(tài)。在培養(yǎng)第4天,可見大量半懸浮和懸浮的imDC;第6天開始加入LPS,24h后懸浮的成熟樹突細(xì)胞(maturedDC,mDC)大量增加且呈簇狀聚集;48h后,mDC的突起明顯變短,簇狀聚集明顯減少,細(xì)胞開始凋亡。熒光顯微鏡下,imDC的F-肌動蛋白的平均熒光強(qiáng)度較低,且細(xì)胞體積較小,觸突較短、較細(xì),所含有的微絲蛋白較少;隨著LPS的刺激,微絲蛋白有所增加,細(xì)胞體積增大,觸突變長、變粗,這種現(xiàn)象在24h組最為明顯;隨著LPS刺激時間的繼續(xù)延長,細(xì)胞體積進(jìn)一步增大,但觸突變短、變細(xì),細(xì)胞膜周圍和觸突的熒光強(qiáng)度均減少,Gourlay等認(rèn)為,這可能與體外長時間培養(yǎng)的DC接近程序性死亡有關(guān)。此時的DC細(xì)胞核直徑增加,細(xì)胞表面觸突減少,細(xì)胞內(nèi)高密度顆粒持續(xù)增多。這說明細(xì)胞核在抗原的內(nèi)吞處理、加工呈遞過程中也發(fā)揮著巨大的作用。細(xì)胞骨架微絲主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核直徑的增大會導(dǎo)致微絲蛋白在細(xì)胞內(nèi)比例的降低,這與在LPS刺激的后期,DC的直徑顯著增大,細(xì)胞觸突減少、變短,