分子病理學(xué)常用研究方法-課件

分子病理學(xué)常用研究方法

(一)1分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件分子病理學(xué)常用研究方法1分子病理學(xué)常用研究方法ppt基因變異的診斷

2分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件基因變異的診斷2分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Southernblot,

PCR,

RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,

FISH分子遺傳學(xué)異常檢測方法3分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Southernblot,分子遺傳學(xué)異常檢測方法3檢測基因的丟失和擴增

比較基因組雜交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物學(xué)技術(shù)與細胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合優(yōu)點：1.新鮮材料和福爾馬林固定石蠟包埋材料均可進行CGH研究2.被測樣品只需數(shù)mg甚至不到1mg的DNA4分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件檢測基因的丟失和擴增4分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件CGH的應(yīng)用：為搜尋腫瘤的癌基因或抑癌基因確定范圍腫瘤細胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)增加，往往提示該位置可能包含已知或未知的癌基因有擴增腫瘤細胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)減少或缺失，提示該位置可能包含已知或未知的抑癌基因丟失CGH發(fā)現(xiàn)MYCN，MET與胃癌相關(guān)6分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件CGH的應(yīng)用：6分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件區(qū)分良惡性病變，臨床上估計預(yù)后

16例前列腺癌CGH顯示染色體異常占81%5例良性前列腺增生全部陰性

67肝細胞癌CGH顯示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化組織：陰性

53例淋巴結(jié)陰性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q異常，預(yù)后差

7分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件區(qū)分良惡性病變，臨床上估計預(yù)后7分子病理學(xué)常用研究方法p蛋白組學(xué)及生物芯片8分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件蛋白組學(xué)及生物芯片8分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片（biochip)是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、RNA）或多肽分子甚至細胞等生物樣品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機（CCD）對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量改變。

9分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片（biochip)9分子病理學(xué)常用研究方法ppt生物芯片：基因芯片蛋白質(zhì)芯片細胞芯片組織芯片基因芯片(Affymetrix專利）

寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因組芯片

DNAmicroarray:陣密度很高的玻片基質(zhì)或膠膜基質(zhì)的DNA微陣列DNAmacroarray:陣密度較低的尼龍膜DNA微陣列

10分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件生物芯片：10分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)-概述一、概述和原理

雜交組織/細胞化學(xué)(Hybridohistochemistry)

原位分子雜交(Insituhybridization,ISH)運用核酸分子間鹼基互補的性質(zhì)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織切片(或細胞片)上顯示特異核酸(DNA或RNA)序列的一種技術(shù)。11分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)-概述一、概述和原理11分子病理學(xué)常用研究方法雜交組織化學(xué)原理標(biāo)記探針雜交變性標(biāo)記探針

──

互補核酸順序DNA/cDNADNADNA/cDNARNARNARNA12分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)原理標(biāo)記探針雜交變性標(biāo)記探針──互核酸分子雜交種類：固相雜交(硝酸纖維素膜或尼龍膜)Southern印跡轉(zhuǎn)移(DNA)Northern印跡轉(zhuǎn)移(RNA)

液相雜交原位雜交原位雜交四要素：

適當(dāng)?shù)奶结樍己玫慕M織材料可靠的試劑和方法相當(dāng)?shù)男螒B(tài)學(xué)基礎(chǔ)13分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件核酸分子雜交種類：固相雜交(硝酸纖維素膜或尼龍膜)13分子二、探針的制備1.探針的種類和制備

DNA探針：應(yīng)用多，操作容易比較敏感，背景高(自身網(wǎng)絡(luò))雙鏈DNA探針用時要變性

整合

轉(zhuǎn)化擴增DNA片段───質(zhì)粒(或其他載體)───細菌───

提取酶切───質(zhì)粒───探針(PCR擴增)14分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件二、探針的制備14分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件線性質(zhì)粒提取質(zhì)粒擴增探針重組質(zhì)粒質(zhì)粒酶切插入轉(zhuǎn)染探針15分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件線性質(zhì)粒擴增探針重組質(zhì)粒質(zhì)粒酶切插入轉(zhuǎn)染RNA探針：結(jié)合穩(wěn)定，穿透性好無需變性，不存在退火問題未雜交探針可用RNase去除，背景好多采用體外轉(zhuǎn)錄法合成同時加以標(biāo)記

寡核苷酸探針：合成快速，不用變性，對RNase不敏感30-150bp，組織通透性好未端標(biāo)記，敏感度不夠多采用DNA合成儀固相合成16分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA探針：結(jié)合穩(wěn)定，穿透性好16分子病理學(xué)常用研究方法探針的選擇:特異性多選擇基因組的5'或3'端20-50對堿基互補就已穩(wěn)定

大小200-300對堿基互補可獲強的復(fù)合體原位雜交多選擇100-400bp(<1000bp)種類穩(wěn)定性：RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA17分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針的選擇:17分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.探針的標(biāo)記

標(biāo)記物：同位素,非同位素,修飾物同位素：敏感，定位較差，實驗室要求高

探針使用周期短

32P放射過強,定位差,半衰期短(14.3天)

35S最常用,定位好,曝光時間短(數(shù)天),半衰期較長(84天)

125I與35S相似，但半衰期較短(60天)

3H常用,放射能小,定位準(zhǔn)確,曝光時間長(數(shù)周),半衰期長18分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.探針的標(biāo)記18分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件非同位素：定位較好，實驗室要求低，可長期使用

生物素：最早用，特點與免疫組化相似地高辛：最常用，敏感性高，特異性好熒光素：方法簡便，敏感性低，多用于染色體檢查

修飾物(現(xiàn)少用)：磺基化(Sulphon基團)乙酰氨基芴光敏生物素汞19分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件非同位素：定位較好，實驗室要求低，可長期使用19分子病理學(xué)常

標(biāo)記方法

引入法：運用標(biāo)記好的核苷酸合成探針缺口翻譯法隨機引物法末端標(biāo)記法PCR擴增標(biāo)記法RNA體外合成法化學(xué)修飾法：化學(xué)修飾已合成的探針20分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件標(biāo)記方法20分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法：雙鏈DNA標(biāo)記，線環(huán)狀均可分子較大(>1KB)者效果好DNA用量較多(>200ng)標(biāo)記率低原理：DNA酶(DNaseI)在雙鏈DNA分子中導(dǎo)入缺口DNA聚合酶(DNApolI，具有5'→3'外切酶和5'→3'聚合酶活性)，使各種核苷酸，包括標(biāo)記核苷酸自缺口處合成與對應(yīng)鏈互補的DNA鏈(探針)變性后標(biāo)記探針分子小，穿透性好21分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法：雙鏈DNA標(biāo)記，線環(huán)狀均可21分子病理學(xué)常缺口翻譯/平移法22分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件缺口翻譯/平移法22分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機引物法：單/雙鏈線狀DNA標(biāo)記，100-500bp亦可DNA用量少(可少至10ng)標(biāo)記率高(1/20-25)原理：以任意順序的六核苷酸片段為引物與單鏈DNA模板結(jié)合后，在DNA聚合酶I的Klenow片段(無5'-3'外切酶活性)作用下合成帶標(biāo)記核苷酸的互補DNA鏈(探針)23分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機引物法：單/雙鏈線狀DNA標(biāo)記，100-500bp亦可2隨機引物法24分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨機引物法24分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中依次加入15μlddH2O1μgDNA(10ng-3μg)100℃10'(變性)干冰聚冷30秒鐘2.加入10×六核苷酸混合物2μl10×dTNP標(biāo)記混合液2μl

含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶(2U/μl)1μl

25分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中依次加入25分子病理學(xué)常用3.混合后37℃保溫1-2h(可達20h)4.加入2μlpH8.0200mMEDTA終止反應(yīng)5.加入2μl糖原(10mg/ml)6.加2.5μl4MLiCl或3MNaAc(pH5.5)7.加75μl無水乙醇(-20℃預(yù)冷)8.混合后-70℃30'9.13000g4℃離心15'，棄上清10.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清11.真空干燥，加50μlTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保存

26分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.混合后37℃保溫1-2h(可達20h)26分子病理學(xué)常末端標(biāo)記法：用于短鏈DNA或寡核苷酸探針標(biāo)記敏感性較低40個以上堿基檢測較穩(wěn)定又分3'端標(biāo)記法和5'端標(biāo)記法3'端標(biāo)記法：原理：DIG-11-ddUTP在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下與寡核苷酸的3'端相連27分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件末端標(biāo)記法：用于短鏈DNA或寡核苷酸探針標(biāo)記27分子病理學(xué)常5'端標(biāo)記法：原理:在堿性磷酸酶的作用下把5‘端磷酸脫去,T4噬菌體多核苷酸激酶將[γ-32P]ATP的γ-32P轉(zhuǎn)移到5'端PCR擴增標(biāo)記法：用于cDNA的合成和標(biāo)記，方法簡單DNA用量少，產(chǎn)量多原理：TaqDNA多聚酶以DNA為模板，在引物引導(dǎo)下合成帶有標(biāo)記核苷酸的cDNA探針。28分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5'端標(biāo)記法：28分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件PCR擴增標(biāo)記法29分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件PCR擴增標(biāo)記法29分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中加入10×PCR緩沖液5μl(1×)MgCl22～10μl(1～5mM)引物適量(0.1～1μM)標(biāo)記/非標(biāo)記dNTP5μl(200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1)

ddH2O加到50μl模板DNA1～100ngTagDNA多聚酶0.2～1μl(1～5units)30分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.于Eppendorf離心管中加入30分子病理學(xué)常用研究方反應(yīng)組對照組1對照組2DNA模板++-Dig-dUTP+--2．混合后PCR儀擴增循環(huán)溫度時間194°C5’94°C45’

2～3155＋0.2°C45’

72°C90’

3272°C5’

334°CHold31分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件反應(yīng)組對照組13.純化和鑒定乙醇沉淀法：100μlPCR產(chǎn)物加10μl4MLiCl和300μl預(yù)冷的100%乙醇，-20?C，2小時，離心4?C13000g，5分鐘Agarose凝膠電泳32分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.純化和鑒定32分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA體外合成/標(biāo)記法：用以合成并同時標(biāo)記RNA探針產(chǎn)量高，NTP濃度要求低，不用純化原理：將模板DNA(雙鏈)插入帶有噬菌體RNApol啟動子的特定質(zhì)粒，在體外RNApol作用下，以DNA為模板、啟動子為起點，合成帶有標(biāo)記核苷酸的RNA探針。33分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件RNA體外合成/標(biāo)記法：用以合成并同時標(biāo)記RNA探針33分子雜交組織化學(xué)RNA體外合成/標(biāo)記法pGEM34分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交組織化學(xué)RNA體外合成/標(biāo)記法pGEM34分子病理學(xué)1.

于Eppendorf離心管中加入DNA模板(酶切成線性)1μg

含噬菌體啟動子的質(zhì)粒NTP標(biāo)記混合物2μl

含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10×反應(yīng)緩沖液2μl

DEPC處理的H2O加至17μl35分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.

于Eppendorf離心管中加入35分子病理學(xué)常

2.混合后加：RNase抑制劑1μl

RNA多聚酶(SP6/T7)2μl

3.柔和混合后37℃保溫2h

4.加入DNaseⅠ2μl，37℃15'(去除模板DNA)

5.加入2μl200mMpH8.0EDTA

6.加入2.5μl4MLiCl和75μl預(yù)冷乙醇

7.混合后置-70℃，30'或-20℃過夜

8.4℃13000g離心15'，棄上清

9.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清10.真空干燥，加100μlDEPC-H2O溶解，-20℃保存

36分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.混合后加：RNase抑制劑化學(xué)修飾法：常用的有光敏生物素、磺化可用以標(biāo)記單/雙鏈DNA或RNA光敏生物素標(biāo)記：光敏生物素+核酸────標(biāo)記探針磺化標(biāo)記：亞硫酸氫鈉和甲基羥胺使胞嘧啶的C5磺化，生成Sulphon基團。乙酰氨基芴(AAF)標(biāo)記：N-acetoxy-AAF與探針一起孵育時，AAF基團與鳥嘌呤核苷殘基共價結(jié)合37分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件化學(xué)修飾法：常用的有光敏生物素、磺化37分子病理學(xué)常用研究方3.標(biāo)記探針的純化目的：去除無機鹽、dNTP、酶等方法：沉淀離心法

加入EDTA中止反應(yīng)，再加4MLiCl和乙醇冷凍離心，乙醇洗滌，干燥后用緩沖液溶解

玻璃纖維濾過法

反應(yīng)物與玻璃纖維結(jié)合，清洗，緩沖液洗脫38分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.標(biāo)記探針的純化38分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.標(biāo)記結(jié)果的檢驗?zāi)康模鹤C實標(biāo)記結(jié)果；估計探針得率；測試檢測條件非同位素標(biāo)記探針的檢驗：采用斑點印跡法不同濃度(10倍梯度稀釋)的標(biāo)記探針點尼龍膜常規(guī)檢測系統(tǒng)顯色未標(biāo)記探針點膜后用標(biāo)記探針雜交39分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.標(biāo)記結(jié)果的檢驗39分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件不同濃度（10倍梯度稀釋）的標(biāo)記探針點尼龍膜DNA／RNA探針：0.01pg～1ng／ul寡核苷酸探針：0.08FM～50fM/ul紫外照光或加熱120℃30’固膜緩沖液1洗膜（100mM馬來酸，150mMNaC1，pH7.5）緩沖液2（1%阻斷劑，緩沖液1配）30’抗DIG一堿性磷酸酶1：5000，孵育30’緩沖液1洗膜緩沖液3浸2’(100mMTris-HC1．100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）顯色液（NBT：BCIP，9:7），作用0.5～16h緩沖液3洗膜40分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件不同濃度（10倍梯度稀釋）的標(biāo)記探針點尼龍膜40分子病理學(xué)常三、組織處理和標(biāo)本制作

目的：保留好被測核酸維持形態(tài)結(jié)構(gòu)

方法：新鮮取材、及時固定適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海?%多聚甲醛(用0.1MPB配制)

用于：冰凍或石蠟切片細胞培養(yǎng)片、細胞涂片或切片41分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件三、組織處理和標(biāo)本制作41分子病理學(xué)常用研究方法ppt課DNA穩(wěn)定性好，一般不需特殊處理

RNA酶的滅活(雜交前)：組織內(nèi)的Rnase:固定劑滅活玻璃器皿：180℃處理3h以上用DEPC(二乙基焦碳酸鹽)水處理試劑：用DEPC水配制和/或高壓消毒帶手套操作RNase抑制劑42分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件DNA穩(wěn)定性好，一般不需特殊處理42分子病理學(xué)常用研檢測RNA時標(biāo)本制備及玻片處理常規(guī)：

切片處理：切片插架──熱水稀釋的中性洗滌劑浸泡30'──流水沖洗──高壓消毒──流水沖洗──蒸餾水洗──180℃3h──APES處理(2%APES/甲醇）室溫1'，甲醇洗──DEPC水洗──陰干

標(biāo)本處理：4%多聚甲醛(PB配)4℃過夜──乙醇脫水──二甲苯透明──石蠟包埋──切片

DEPC水：0.1DEPC，室溫放置3h，高壓消毒43分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件檢測RNA時標(biāo)本制備及玻片處理常規(guī)：43分子病理學(xué)常用研究方四、原位分子雜交

要求：提高敏感性降低非特異著色

方法：去垢劑(TritonX-100)：增強組織通透性

蛋白酶(蛋白酶K)消化：增加通透性、去除雜蛋白

稀酸：雜蛋白變性、去內(nèi)源性酶、暴露靶核酸

乙?；幚恚褐泻完栯x子，減少靜電吸引

適當(dāng)?shù)碾s交條件：溫度、離子強度、pH探針的種類、大小、濃度

雜交液：葡聚糖：增加探針相對濃度魚精DNA、tRNA的應(yīng)用：封閉

充分洗滌44分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、原位分子雜交44分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.雜交前處理石蠟切片常規(guī)脫蠟，PB洗片，[TritoX-100]蛋白酶K消化，37℃，(1～15μg/ml，15～120')4%多聚甲醛后固定，室溫10'PB洗片1～2'×2；0.2MHCl，室溫10'；PB洗片1～2'×20.1M三乙醇胺(DEPC-H2O配)，室溫2～3'三乙醇胺/無水乙酸室溫10'PB洗片，室溫2'×270%→80%→90%→100%→100%酒精脫水室溫干燥45分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件1.雜交前處理45分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.雜交（預(yù)雜交）滴加雜交工作液，蠟?zāi)どw片，濕盒內(nèi)，50℃16～20h(檢測DNA時要求先變性(90~100度)，探針為雙鏈DNA也要變性)

雜交液：甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到50.0mlNaCl600mM-70℃保存Denhart's液1×SDS0.25%46分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件2.雜交46分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml雜交工作液：1ml雜交液加tRNA(最終濃度0.3～0.5mg/ml)加標(biāo)記探針(最終濃度0.5～5μg/ml)每張切片用50μl47分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400雜交條件的優(yōu)化：

溫度：溫度高反應(yīng)快，溫度太高破壞組織，一般Tm-25℃G:C多者Tm高(G:C50%Tm約為70℃)甲酰胺可降低雜交溫度(1%下降0.35～0.65℃)

探針：長的雜交快(太長時穿透性差)復(fù)雜性高的雜交時間長濃度高雜交時間短離子強度和pH：離子強度高雜交體穩(wěn)定性好（0.01-0.4M)兩價陽離子可使DNA結(jié)合牢固，用EDTA去除常用50%甲酰胺，pH6.5～7.5，45～65℃，雜交16～20h48分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雜交條件的優(yōu)化：48分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.雜交后處理

洗片：5×SSC，50℃1'去膜；5×SSC，50℃5'2×SSC+50%甲酰胺，50℃30'TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，37℃10'

RnaseA(1mg/100mlTNE)，37℃30'TNE，37℃10'2×SSC，50℃15'；0.2×SSC，50℃15'×2

嚴(yán)格度：甲酰胺濃度高溫度高高嚴(yán)格度離子強度低49分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.雜交后處理49分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.顯色反應(yīng)(大致同免疫組化)BufferⅠ(0.1MTris-HClpH7.5含0.15MNaCl)，室溫1'1.5%阻斷劑(用BufferⅠ加熱配制)，室溫45'抗DIG-AP，37℃30～60'，4℃過夜BufferⅠ，室溫15'×2BufferⅢ浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室溫5'，顯色液(NBT+BCIP+2mlBufferⅢ)，避光室溫，30'以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反應(yīng)H2O洗片甘油明膠封片50分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.顯色反應(yīng)(大致同免疫組化)50分子病理學(xué)常用研究方法5.對照陰性組織片對照陽性組織片對照(包括分布)探針Northernblot檢測探針正義鏈陰性對照不標(biāo)記探針競爭抑制不含探針的陰性對照(顯色階段對照)DNase或RNase消化后陰性對照(非核酸吸附)核酸原位雜交與蛋白產(chǎn)物的免疫組化檢測對照其他陽性或陰性對照（載體對照）51分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件5.對照51分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、雜交組化技術(shù)的進展1.雙重及多重雜交組化技術(shù)（最好選擇不同的檢測系統(tǒng)）2.與免疫組化結(jié)合應(yīng)用雙重檢測(一般先作免疫組化)同時檢測核酸和蛋白產(chǎn)物3.電鏡下的雜交組化方法與免疫電鏡相似多采用PG或PLP固定、包埋后法、膠體金標(biāo)記細胞則多用包埋前法52分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件四、雜交組化技術(shù)的進展52分子病理學(xué)常用研究方法ppt課4.原位PCR技術(shù)將PCR與雜交技術(shù)結(jié)合起來，以提高敏感性間接原位PCR：先擴增后雜交方便、敏感、特異性差直接原位PCR：加入引物、標(biāo)記核苷酸、DNA聚合酶等，直接以靶鏈為模板合成DNA并檢測出相對的DNA雜合體5.原位反轉(zhuǎn)錄PCR（也分直接和間接法）在PCR擴增前先進行反轉(zhuǎn)錄，rTth酶的出現(xiàn)使其更為容易53分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件4.原位PCR技術(shù)53分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件五、雜交組化的應(yīng)用1.病原體的檢測病毒：HPV(16，18)──宮頸癌

EBV──鼻咽癌

HBV──肝癌、肝炎──腎炎(IgA腎病)

CMV──AIDS病等原位PCR顯示肝炎肝細胞內(nèi)HCV陽性54分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件五、雜交組化的應(yīng)用原位PCR顯示肝炎肝細胞內(nèi)HCV陽性54

2.腫瘤基因檢測癌基因的染色體定位癌基因mRNA檢測──癌基因活化宮頸癌癌細胞內(nèi)p53的表達55分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件宮頸癌癌細胞55分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.mRNA檢測(敏感性較Northernblot低，可精確到細胞水平)原位雜交顯示腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞TIMP-2陽性56分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件3.mRNA檢測原位雜交顯示腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞T熒光原位雜交---FluorescenceInSituHybridization原理采用熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與被檢測樣本DNA堿基對的互補性，在探針與樣本的DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結(jié)果，從而檢測細胞，組織樣本中的染色體異常。57分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件熒光原位雜交原理57分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH：“釣魚”技術(shù)58分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH：“釣魚”技術(shù)58分子病理學(xué)常用研究方法p59分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件59分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件細胞周期的不同階段60分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件細胞周期的不同階段60分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件61分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件61分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針是一段熒光標(biāo)記的核酸（DNA）片段，被用作尋找另一互補DNA(靶標(biāo)）的指示。DNA靶標(biāo)可能是一個特異性條帶、一個基因、一個染色體片段或一個完整染色體探針（probe)及靶標(biāo)（target)62分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件探針是一段熒光標(biāo)記的核酸探針（probe)及靶標(biāo)（targ適用于間期FISH的標(biāo)本石蠟切片分離細胞核腫瘤組織的印片細胞離心涂片血液或骨髓涂片細胞爬片或切片63分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件適用于間期FISH的標(biāo)本石蠟切片63分子病理學(xué)常用研究方FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）染色體計數(shù)（著絲粒）探針（CEP）位點特異性探針（LSI）雙色分離重排探針雙色雙融合易位探針xyxx64分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）xyxx64可檢測樣本包括65分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件可檢測樣本包括65分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件66分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件66分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床應(yīng)用領(lǐng)域67分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床應(yīng)用領(lǐng)域67分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件68分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件68分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因69分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因69分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件70分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件70分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件

HPV→hTERC=宮頸癌？71分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件

HPV→hTERC=宮頸癌？71分子病理學(xué)常用研究方72分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件72分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件子宮頸癌研究最新進展中國醫(yī)學(xué)論壇報/2008年/12月/4日/第B03版IGCS2008會議報道hTERC擴增診斷宮頸癌及癌前病變

目前宮頸癌篩查主要通過宮頸細胞學(xué)檢查及人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測，但這些方法的臨床應(yīng)用均有一定局限性。今年的研究致力于尋找新的指標(biāo)來協(xié)助診斷宮頸癌前病變，尤其是鑒別出高度病變，以提高篩查的準(zhǔn)確性和可預(yù)測性。人端粒酶RNA（hTERC）是人端粒酶組分之一，有研究證實，端粒酶激活是HPV整合入宮頸細胞后，上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。此次大會口頭報告中北京大學(xué)人民醫(yī)院魏麗惠等提交的一項研究頗為引人注目，該研究發(fā)現(xiàn)，通過熒光原位雜交（FISH）檢測宮頸細胞學(xué)涂片中hTERC基因擴增情況，在宮頸癌和癌前病變診斷中具有重要價值。73分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件子宮頸癌研究最新進展中國醫(yī)學(xué)論壇報/2008年/12月/4日TERC與子宮頸癌級別國內(nèi)1000多例臨床實驗結(jié)果74分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC與子宮頸癌級別國內(nèi)1000多例臨床實驗結(jié)果74分子病TERC在臨床中的意義75分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義75分子病理學(xué)常用研究方法ppt課TERC在臨床中的意義-風(fēng)險預(yù)測針對HPV高危的宮頸癌易感人群,在常規(guī)TCT篩查的基礎(chǔ)上,加做TERC基因檢測,可幫助醫(yī)生判斷病人疾病風(fēng)險76分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-風(fēng)險預(yù)測針對HPV高危的宮頸癌易感人

改進的子宮頸癌篩查與診斷手段77分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件改進的子宮頸癌篩查與診斷手段77分子病理學(xué)常用研究方法TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療78分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療78分子病TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療79分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN1患者的分流治療79分子病理TERC在臨床中的意義-CIN2患者的分流治療80分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-CIN2患者的分流治療80分子病理TERC在臨床中的意義-術(shù)后評估，復(fù)發(fā)監(jiān)測

TERC（-）：手術(shù)病灶切除干凈，并無復(fù)發(fā)，定期隨訪觀察TERC（+）：高度懷疑有病灶沒有被完全切除，或者有復(fù)發(fā)。根據(jù)病人情況再次進行手術(shù)治療81分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-術(shù)后評估，復(fù)發(fā)監(jiān)測

TERC（-）：TERC在臨床中的意義-鑒別診斷對于30歲以前HPV陽性的病人，大多是一過性感染，可用TERC探針進行鑒別診斷。

TERC（-）：一過性感染TERC（+）：有癌變風(fēng)險，采取治療措施對于懷孕期的婦女，雌激素可使移行帶區(qū)的基底細胞出現(xiàn)不典型增生甚至類似原位癌的改變，與宮頸原位癌鑒別困難。但前者在產(chǎn)后能恢復(fù)正常。TERC（-）：雌激素引起，無需治療，產(chǎn)后自然恢復(fù)正常TERC（+）：高度懷疑原位癌，密切隨診，產(chǎn)后六周進行相應(yīng)治療82分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-鑒別診斷對于30歲以前HPV陽性的病TERC在臨床中的意義-鑒別診斷CIN1和CIN2病理學(xué)上有時難以區(qū)分，但是對指導(dǎo)臨床的治療有重要意義TERC（-）：90%可能為CIN1，按CIN1方案治療TERC（+）：90%可能為CIN2，按CIN2方案治療83分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC在臨床中的意義-鑒別診斷CIN1和CIN2病理學(xué)上有TERC指導(dǎo)臨床治療小結(jié)84分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC指導(dǎo)臨床治療小結(jié)84分子病理學(xué)常用研究方法ppt臨床常用檢測項目-宮頸癌85分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件臨床常用檢測項目-宮頸癌85分子病理學(xué)常用研究方法pp三種檢測方法比較方法特異性（％）敏感性（％）形態(tài)學(xué)檢測9055-80HPV檢測64－9584-100FISH909086分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件三種檢測方法比較方法特異性（％）敏感性（％）形態(tài)學(xué)檢測905TERC基因陽性圖原位癌術(shù)后復(fù)查87分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因陽性圖原位癌術(shù)后復(fù)查87分子病理學(xué)常用研究方法TERC基因陰性圖88分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因陰性圖88分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因FISH檢測檢測樣本：TCT采集、生理鹽水采集、活檢標(biāo)本石蠟切片、手術(shù)標(biāo)本石蠟切片89分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TERC基因FISH檢測檢測樣本：89分子病理學(xué)常用研究方法90分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件90分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測TERC基因的結(jié)果判讀：標(biāo)本為新鮮宮頸細胞制片：閾值建立采集20例正常人宮頸細胞。閾值測定：每例分析至少100個細胞，統(tǒng)計出現(xiàn)2個以上TERC信號細胞數(shù)目的百分比。閾值=平均數(shù)（M）+3X標(biāo)準(zhǔn)差（SD）結(jié)果判斷每例樣本隨機計數(shù)細胞（至少100個），如果檢測值大于閾值，判定為陽性結(jié)果；如果檢測值小于閾值，判定為陰性結(jié)果；如果檢測值等于閾值，加大觀測樣本細胞數(shù)目。標(biāo)本為組織石蠟切片：連續(xù)3個細胞出現(xiàn)2個以上TERC信號，即判為陽性。91分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測TERC基因的結(jié)果判讀：91分子病理學(xué)常用研究方FISH檢測Her-2基因擴增92分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測Her-2基因擴增92分子病理學(xué)常用研究方法93分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件93分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件94分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件94分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件95分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件95分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件96分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件96分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件97分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件97分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴增模式98分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴增模式98分子病理學(xué)常用研究方法ppt課Her-2基因擴增模式99分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Her-2基因擴增模式99分子病理學(xué)常用研究方法ppt課100分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件100分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用101分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用101分子病理學(xué)常用研究方法ppt課102分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件102分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨訪終點指標(biāo)103分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件隨訪終點指標(biāo)103分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用—小結(jié)104分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件赫賽汀在胃癌中的應(yīng)用—小結(jié)104分子病理學(xué)常用研究方法p105分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件105分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TOP2A基因106分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件TOP2A基因106分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件測TOP2A基因的意義107分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件測TOP2A基因的意義107分子病理學(xué)常用研究方法ppt108分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件108分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計Ratio值（紅信號數(shù)/綠信號數(shù)）FISH陽性：1.EGFR基因擴增（1）Ratio≥2為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴增（2）大于等于15個紅色信號的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的10%以上，為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴增（3）出現(xiàn)成團擴增的細胞，為陽性結(jié)果，提示該樣本有EGFR基因擴增2.高多體性

Ratio＜2，但大于等于4個紅色信號的細胞占細胞總數(shù)的40%以上，為陽性結(jié)果，提示該樣本為EGFR基因高多體性擴增FISH陰性除以上陽性情況上，其余結(jié)果均為陰性結(jié)果109分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計Ratio值（紅信號數(shù)/綠信號數(shù)）10淋巴瘤的診斷和治療——對病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生的挑戰(zhàn)淋巴瘤的分類復(fù)雜（2008年WHO分類）不同類型的淋巴瘤有著不同的預(yù)后，需要不同的治療；即使是相同類型的腫瘤，由于攜帶不同的分子遺傳學(xué)異常，對治療的反應(yīng)也可能不同;多數(shù)淋巴瘤綜合臨床特征、組織形態(tài)學(xué)、免疫表型特征可得到正確診斷;分子遺傳學(xué)的檢測可以提供更多普通病理學(xué)檢查所不能提供的信息。110分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件淋巴瘤的診斷和治療——淋巴瘤的分類復(fù)雜（2008年WHO分診斷BCDA臨床特征形態(tài)學(xué)免疫表型分子遺傳學(xué)淋巴瘤診斷—臨床特征、形態(tài)學(xué)、免疫表型及分子遺傳學(xué)相結(jié)合111分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件診斷BCDA臨床特征形態(tài)學(xué)免疫表型分子遺傳學(xué)淋巴瘤診斷1淋巴瘤常見的染色體易位及所累及基因112分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件淋巴瘤常見的染色體易位及所累及基因112分子病理學(xué)常用研究方FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的常用探針雙色分離重排探針（DualColorBreakApartRearrangementProbe）雙色雙融合易位探針（DualColor，DualFusionTranslocationProbe）染色體計數(shù)探針（Chromosomeenumerationprobe,CEP）113分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的常用探針雙色分離重排探針1①切片準(zhǔn)備：選擇雜交區(qū)域，脫蠟水化、酶消化、脫水干燥②變性、雜交③洗滌、封片④觀察：熒光顯微鏡。間期FISH方法114分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件①切片準(zhǔn)備：選擇雜交區(qū)域，脫蠟水化、酶消化、間期FISH方法間期FISH結(jié)果觀察與解讀115分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀115分子病理學(xué)常用研究方法p雙色分離重排探針（BCL2）正常分離基因拷貝數(shù)增加116分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件雙色分離重排探針（BCL2）正常分離基因拷貝數(shù)增加116分子間期FISH結(jié)果觀察與解讀117分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀117分子病理學(xué)常用研究方法p正常融合基因拷貝數(shù)增加雙色融合易位探針(IGH/BCL2）118分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件正常融合基因拷貝數(shù)增加雙色融合易位探針(IGH/BCL2）間期FISH結(jié)果觀察與解讀119分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH結(jié)果觀察與解讀119分子病理學(xué)常用研究方法p正常染色體數(shù)目增加染色體著絲粒探針（2號染色體，橙色）120分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件正常染色體數(shù)目增加染色體著絲粒探針120分子病理學(xué)常用研究方有助于診斷、分類通過特異性遺傳學(xué)異常來確定淋巴瘤的類型判定預(yù)后、指導(dǎo)治療

FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的意義121分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件有助于診斷、分類FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常的意義121間期FISH在淋巴瘤中的應(yīng)用舉例侵襲性成熟B細胞淋巴瘤小細胞性B細胞淋巴瘤

外周T細胞淋巴瘤

B淋巴母細胞性淋巴瘤/白血病122分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件間期FISH在淋巴瘤中的應(yīng)用舉例侵襲性成熟B細胞淋巴瘤12Burkitt淋巴瘤(BL)t(8q24)/IG-cMYC具有介于彌漫大B細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之間特征的不能分類的B細胞淋巴瘤(IntermediateBL/DLBCL)（Double-hit）t(8q24)/nonIG-cMYC（35-50%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（15%）t(3q27)/BCL6-IGH

（少）彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)（Double-hit）

t(8q24)/IG(nonIG)-cMYC（10%）

t(3q27)/BCL6（30%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（20-30%）t(3;14)(p14;q32)/FOXP1-IGH（3%）侵襲性成熟B細胞淋巴瘤123分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件Burkitt淋巴瘤(BL)侵襲性成熟B細胞淋巴瘤123分利用FISH檢測以上三個類型淋巴瘤的分子遺傳學(xué)異常，通常使用以下探針：雙色分離重排探針：IGH、C-MYC、BCL2、BCL6雙色雙融合易位探針：IGH/C-MYC

侵襲性成熟B細胞淋巴瘤124分子病理學(xué)常用研究方法ppt課件利用FISH檢測以上三個類型淋巴瘤的分子遺傳學(xué)異常，通常使用Burkitt淋巴瘤

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