Infusion技術(shù)-教學(xué)講解課件

In-Fusion

克隆技術(shù)介紹9/5/2023In-Fusion

克隆技術(shù)介紹7/30/2023基因克隆背景簡(jiǎn)介TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點(diǎn)：連接效率低耗時(shí)較長(zhǎng)需要特定限制性酶切位點(diǎn)9/5/20232基因克隆背景簡(jiǎn)介TA克隆限制性酶切克隆平滑末端克隆缺點(diǎn)：連接In-Fusion克隆產(chǎn)品Clontech專利In-Fusion?HDCloningSystem任意載體任意基因片段這是一款讓您隨心所欲地實(shí)現(xiàn)基因定向克隆的產(chǎn)品！9/5/20233In-Fusion克隆產(chǎn)品In-Fusion?HDCloIn-Fusion?基因克隆特點(diǎn)4

In-Fusion?基因克隆特點(diǎn)44主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理9/5/20235主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusi05September20236

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理30July20236主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)6In-Fusion?基因克隆技術(shù)原理示意圖In-Fusion專利酶Clontech專利In-Fusion是一種快速、簡(jiǎn)單、高效的基因克隆技術(shù)！50℃，15min單管反應(yīng)7

In-Fusion?基因克隆技術(shù)原理示意圖In-Fusion705September20238

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理30July20238主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)8In-Fusion?克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)不附加任何多余序列2不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制3可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段41簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)9/5/20239In-Fusion?克隆技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)不附加任何多余序列2不受限簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)

快速！9/5/202310簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)快速！7/30/202310In-FusionHD無(wú)論是克隆長(zhǎng)基因片段還是克隆多個(gè)基因片段都能保持較高的克隆效率。

高效！簡(jiǎn)便、快速、高效的克隆技術(shù)9/5/202311In-FusionHD無(wú)論是克隆長(zhǎng)基因片段還是克隆多個(gè)基因不附加任何多余序列線性化載體任意載體克隆位點(diǎn)目的DNA片段不需要的堿基序列引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增與載體相同的15個(gè)堿基序列In-Fusion連接反應(yīng)15min

不附加任何多余序列的重組載體無(wú)縫克隆：不附加任何多余序列ABC9/5/202312不附加任何多余序列線性化載體任意載體克隆位點(diǎn)目的DNA片段不不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制In-Fusion克隆不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制:在cDNA序列中插入內(nèi)含子,熒光蛋白基因在cDNA序列添加UTRs

轉(zhuǎn)換純化標(biāo)簽例如Myc

轉(zhuǎn)換為His

缺失蛋白表達(dá)區(qū)域…表達(dá)載體選擇插入位點(diǎn)PCR擴(kuò)增純化目的DNA片段混合In-FusionIn-Fusion引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增重組載體9/5/202313不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制In-Fusion克隆不受限制可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段Step2:目的DNA片段擴(kuò)增Step3:一次In-Fusion連接反應(yīng)Step1:制備線性化載體片段1片段2片段3線性化載體重組載體9/5/202314可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段Step2:目的DNA片段克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)的限制克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限制In-Fusion解決方案載體的限制不同克隆試劑盒都需要與之匹配的載體必須使用提供的載體只要載體末端和插入片段末端具有15個(gè)同源堿基，In-Fusion就可以將任意PCR片段插入任意線性化載體中。必須進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和連接需要獨(dú)一無(wú)二、兼容的酶切位點(diǎn)極少的合適酶切位點(diǎn)In-Fusion不受限制性酶切位點(diǎn)的限制，因此在目的片段及使用的載體中是否存在合適的酶切位點(diǎn)并不妨礙克隆。亞克隆繁瑣多片段不能同時(shí)克隆In-Fusion能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)克隆多個(gè)片段，無(wú)需進(jìn)行亞克隆。對(duì)于大片段克隆效率較低對(duì)于插入片段有限制In-Fusion系統(tǒng)能夠高效克隆0.05-15kb

DNA片段。非定向克隆需要篩選目的片段插入方向正確的克隆In-Fusion是基因定向克隆技術(shù)，因此無(wú)需進(jìn)行目的基因片段正確插入的克隆的篩選。會(huì)附加多余堿基序列In-Fusion是無(wú)縫克?。翰桓郊尤魏味嘤鄩A基序列。不適合中型和大規(guī)模克隆工程In-Fusion技術(shù)已經(jīng)成功用于多項(xiàng)高通量克隆工程。9/5/202315克服傳統(tǒng)克隆技術(shù)的限制克服其它克隆技術(shù)的限制其它克隆技術(shù)的限In-Fusion?克隆技術(shù)的應(yīng)用多片段克隆構(gòu)建載體模型插入突變位點(diǎn)高通量克隆9/5/202316In-Fusion?克隆技術(shù)的應(yīng)用多片段克隆構(gòu)建載體模型插入應(yīng)用實(shí)例實(shí)例：多個(gè)DNA片段（1kb,2kb,3kb)同時(shí)克隆【方法】使用TaKaRa高品質(zhì)PCR酶分別擴(kuò)增1kb、2kb、3kb的目的DNA片段

和2.7kb的載體，并將擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用In-Fusion?HD試劑盒完成克隆。利用高效率的感受態(tài)細(xì)胞StellarTMCompetentCells（產(chǎn)品編

號(hào)：636763）轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選。9/5/202317應(yīng)用實(shí)例實(shí)例：多個(gè)DNA片段（1kb,2kb,3k引物設(shè)計(jì)及目的基因片段擴(kuò)增引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列9/5/202318引物設(shè)計(jì)及目的基因片段擴(kuò)增引物的5’末端必須包含與載體末端相載體線性化PCR擴(kuò)增酶切處理9/5/202319載體線性化PCR擴(kuò)增酶切處理7/30/202319In-Fusion連接反應(yīng)In-Fusion專利酶線性化載體目的基因片段反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化In-Fusion連接反應(yīng)50℃15min【結(jié)果】CloningEnhancer處理，37℃15min，80℃15min9/5/202320In-Fusion連接反應(yīng)In-Fusion專利酶線性化載體引物設(shè)計(jì)原則引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基序列引物的3’末端必須包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列05September202321

引物設(shè)計(jì)原則引物的5’末端必須包含與載體末端相同的15個(gè)堿基21引物設(shè)計(jì)原則05September202322

引物設(shè)計(jì)原則30July20232222引物設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)工具在線支持工具9/5/202323引物設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)工具在線支持工具7/30/20232305September202324

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理30July202324主要內(nèi)容2In-Fusion?24產(chǎn)品列表9/5/202325產(chǎn)品列表7/30/202325基礎(chǔ)款相關(guān)產(chǎn)品5XIn-FusionHDEnzymePremixpUC19ControlVector,linearized(50ng/μl)2kbControlInsert(40ng/μl)In-Fusion?HDCloningKit（639648/49/50)組分9/5/202326基礎(chǔ)款相關(guān)產(chǎn)品5XIn-FusionHDEnzyme附帶CloningEnhancer的相關(guān)產(chǎn)品CloningEnhancer的作用：消除PCR反應(yīng)液中的引物二聚體和dNTP等的影響無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化操作簡(jiǎn)單In-Fusion?HDCloningKitw/CloningEnhancer(639633/34/35)9/5/202327附帶CloningEnhancer的相關(guān)產(chǎn)品CloningUpto5XHigherEfficiency未經(jīng)處理CloningEnhancer處理CloningEnhancer的實(shí)用例9/5/202328Upto5XHigherEfficiency未經(jīng)處理05September202329

主要內(nèi)容2In-Fusion?優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用實(shí)例3In-Fusion?系列產(chǎn)品介紹4常見(jiàn)問(wèn)答1In-Fusion?克隆技術(shù)的原理30July202329主要內(nèi)容2In-Fusion?29In-FusionKit常見(jiàn)問(wèn)答Q1.如何選擇PCR酶？A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人員進(jìn)行克隆表達(dá)的實(shí)驗(yàn)較多，我們推薦使用高保真的PCR酶。Q2.載體和插入的DNA片段末端結(jié)構(gòu)有限制嗎？A2.沒(méi)有特別的限制。無(wú)論是平滑末端、粘性末端或者末端有無(wú)A尾均可

進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。Q3.載體和插入的DNA片段的長(zhǎng)度有限制嗎？A3.沒(méi)有特別的限制。載體和插入的DNA片段即使超過(guò)10kb也可以進(jìn)

行連接反應(yīng)，只是連接效率會(huì)有所降低。插入的DNA片段只要不少

于50bp就可進(jìn)行有效的連接反應(yīng)。Q4.線性化載體末端是否需要進(jìn)行去磷酸化處理？A4.線性化載體末端磷酸基團(tuán)的